なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em>ショウジョウバエ</em>幼虫の神経筋接合部

1.実験の準備注：セクション2と3での解剖と免疫組織化学の手順は3-6が、変更を加えた参考文献に従って行われます。 1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、0.1％トリトンX-100を含有するPBS（PBT）を準備します。氷の上に保管しておいてください。 ブアン固定液を準備します（15ピクリン酸：10ホルムアルデヒド：1氷酢酸）。この試薬は新鮮ください。 きれいなステンレス鋼minutienピンと細かい鉗子を選択します。 5センチメートルペトリ皿にシルガードディスクを含む解剖プレートを準備します。 第三齢幼虫のNMJの2解剖細かいブラシでバイアルまたはボトルから第三齢幼虫をさまよう選び、残留食べ物を洗い流すために4℃でPBSを含む2センチメートルペトリ皿に入れます。 解剖プレートのシルガード面の上に1幼虫を置き、それがPOSITIであることを確認してください2つの長手方向の気管チューブが上に表示されるようにその背側を上にしてoned。 ピンを保持するために鉗子を使用して、右の口のフックの下で、その前端に幼虫を突き止めます。できるだけ多くの幼虫を伸ばし、その後部がダウンして終了ピン。 プレートの壁に到達するのに十分なPBS生理食塩水を加え、完全に幼虫を浸します。 同じ遺伝子型の他の幼虫のために2.3の手順2.1から手順を繰り返します。シングル5センチメートルペトリ皿の解剖プレートは簡単に8幼虫まで収容することができます。 顕微解剖ハサミを使用して、少し背のキューティクルを持ち上げ、ピンの近くに後部端に小さな水平切開を行います。 切開部にはさみを入れ、すべての方法気管の2つの縦管の間の正中線に沿って前端に幼虫を切りました。正中線のカットはちょうどキューティクルを通過すると、上の筋肉を切断を回避するのに十分な表面的であることを確認してください腹側。 各端部で、左右両側に2つのノッチをカットします。 前方切開部の両側に2本のピンを配置することにより、フィレットを開きます。後端で同じことを繰り返します。ピンを配置すると、離れて体壁を広げていることを確認してください。 鉗子とPBS生理食塩水を使用して内臓を一掃。無傷の中枢神経系を残します。ゆっくりとそれが完全に延伸されるまで、コーナーピンと幼虫を伸ばすが、筋肉は、このプロセスの間に引き裂かれていないことを確認してください。 同じ解剖プレート上の他の幼虫のために同じ解剖手順を繰り返します。 すべての内臓を除去するために、PBS生理食塩水で3回洗浄します。 ブアン固定液を含むPBSを交換し、10分間室温で残します。 PBTで数回洗浄します。 慎重にピンを取り外し、免疫染色のために1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに今かなり剛性であるすべての準備を、転送します。筋肉や筋核に特異的な抗体でショウジョウバエのNMJの3免疫組織化学染色迅速にPBTで幼虫の切り身をすすぎます。 一定の撹拌下で2時間、PBTに10％正常ヤギ血清（NGS）とインキュベートすることによって準備をブロックします。 2時間：（500 1の濃度で）とモルモット抗DVAP抗体と：NGSの5％を含むPBTにおける解剖のNMJのセットと（500 1の濃度で）ウサギ抗ラミン抗体をインキュベート室温または4ºCで一晩。抗ラミン染色は筋核の輪郭を検出しながら、抗DVAP抗体は、横紋筋肉を染色します。 過剰に抗体を除去するために、PBTに一度すぐに洗います。 PBTは15分ごとにバッファ変更することにより、2時間、PBTで洗浄します。 1で5％NGSおよび蛍光標識二次抗体を含有するPBT中のサンプルをインキュベートする：室温で2時間500希釈を。同じ試料C異なる発色団と結合した二次抗体が使用されている場合、同時に複数の抗体を用いた染色に供されます。 二次抗体を除去し、PBTバッファごとに15分を変更することで、2時間、PBTで洗います。 筋核の内部を染色するには、PBSでサンプル3回洗浄し、以下の手順に従います。 PBSで千をし、一定の撹拌下で20分間インキュベート：1の希釈でTO-PRO-3核マーカーを追加します。このマーカーは、本研究で使用されているが、任意の他の商業的に入手可能な核マーカーを使用することもできます。 マウントする前にPBSで素早く3回洗浄します。 スライド4.マウントサンプル 1.5ミリリットルマイクロ遠心管から鉗子でサンプルをピックアップし、処理スライド上に置きます。 マイクロ解剖ハサミを使用することにより、ヘッドとフィレットの尾をカットし、その内面アップを続けます。 目を準備電子互いから約1cmの距離できれいなスライドの両側にセルローステープの3ストリップを周りにラップすることによって、スライドをマウントします。カバースリップは、2つのストリップの上に配置されると、ギャップは、サンプルの平坦化が回避され、その生成されます。構造物の三次元ボリュームレンダリングを行うことになっている場合、これは重要です。 3セルローステープストリップとの間の取り付けスライドの真ん中にマウンティング培地約20μlの小滴を入れてください。 きれいなピンセットでマウンティング培地を拡散した後、内面アップを維持、マウント培地にマウントスライドに解剖幼虫をドラッグします。 4または5の列にそれらをマウントしてみてください。 ゆっくり取付スライドの上にカバースリップを削除し、空気の泡が発生しないことを確認してください。透明なマニキュア液でスライドを密閉します。サンプルは撮影前に少なくとも10分間乾燥させます。 イメージング用5.共焦点設定注：E倒立顕微鏡：この研究で提示される画像は、Ti上に集積ニコンA1R共焦点ユニットを使用して撮影されています。しかし、488ナノメートルの波長領域で使用可能な3レーザユニットの最小を有する任意の共焦点顕微鏡、561 nmおよび642 nmおよび3チャネル検出システムは、この目的に適しています。 レーザー、検出器ユニット、水銀球、ステージコントローラ、顕微鏡とPCをONにしてください。制御ソフトウェアを起動して、ステージホルダーのスライドを固定します。 、より高速イメージングを行うことを選択し、20Xの対物レンズを用いて試料の利息（ROI）の全ての領域をマークします。 慎重60X高倍率の対物レンズ（60XプランアポVC / NA 1.4 OIL）にノーズピースを振ります。 対物レンズにイマージョンオイルの滴を置き、コンピュータ上のXYZの概要ウィンドウからマークされたROIのいずれかを選択します。 以下の光学設定を使用して撮影を開始します。最初のダイクロイックミラーを選択：48分の405を8/561/640。発光フィルタは、チャンネル1、チャンネル3でのロングパスフィルターが650nmとチャンネル2と642 nmレーザーで50分の595発光フィルターと561 nmのレーザーでNMを525/50と488 nmのレーザーを選択します。 画像取得を開始する前に、次のスキャン設定を使用します。ガルバノスキャナを選択します。スキャン方向：一方向;スキャン速度：毎秒0.5コマ。 チャネルブリードスルーを回避するために、チャネル・シリーズを選択します。 1エアリー単位にピンホールのサイズを調整します。スキャンし、レーザパワー検出ゲインを調整し、画素の彩度とバックグラウンドレベルを回避するために、各チャネルに対して適切にオフセット。 ROIとスライドの準備すべてのためにボクセルサイズ0.2×0.2×0.5μmの3を使用してのzスタックを取得します。画像はデコンボリューションに供される場合には、0.06のx 0.06のx 0.15μmの3にボクセルサイズを設定します。 .nd2ファイル形式またはの.ics形式で画像を保存します。 横紋内の核間の距離の6計算60;最近隣分析の手法による筋肉この分析のために、筋肉を視覚化し、ラミン抗体および核を強調するために核マーカーとするDVAP抗体で染色した幼虫の体壁の筋肉を表示する共焦点画像を使用しています。 核の間の最も近い距離を推定するために、画像解析ソフトウェア（ 例えば 、IMARIS）のMeasurementProモジュール内の測定ポイントを使用しています。画像解析のための他の同様のソフトウェアアプリケーションは、同じ目的のために使用することができます。 共焦点画像を開きます。 、ソフトウェアアイコンをダブルクリックを開始します。ドラッグアンドアリーナに共焦点zスタック画像をドロップします。 自動的にメニューツールバーアイコンの下に、サーパスビューでそれらを開くために、画像をダブルクリック 。ビューエリア、プロパティエリアをリストオブジェクトとオブジェクト：サーパスビューは、3つの主要なワークスペースパネルを持っています。 トンボリュームレンダリングを作成します。メニューアイコン3DビューをクリックしてHREEチャンネル画像 。 新規追加測定ポイントのアイコンをクリックしてくださいから オブジェクトは、ツールバーやオブジェクトのプロパティエリアに表示されます作成ウィザードに従ってください。 作成ウィザードから、最初の[編集]タブを選択し、特定のチャネル。核を強調するために、核マーカーまたはラミンチャネルのいずれかを選択します。 キーボードのEscキー]タブを押して、選択モードへのポインタを設定します。 画像内の指定された核を含むように、マウスホイールで3Dカーソルボックスのサイズを調整します。同じ核のShiftキーとマウスの左クリックを保持することにより、測定点を追加します。 前の手順を繰り返して、同じ筋肉に近く核上の第二の点を追加します。行が自動的に2点と測定された距離との間に描かれています 2つの核が表示されます。 2つの核間の距離は、現在のタブの統計>詳細>距離データの下のオブジェクトのプロパティエリアで統計的変数として記録されています。 指定された核を取り巻く全ての核のために6.10までの手順6.6から手順を繰り返します。 統計から>収集したすべての測定点を表示詳細>距離データは、最短距離を選択します。 ファイルにタブ表示に書き出し統計をクリックしてオブジェクトのプロパティエリアの下で入手可能な、データがスプレッドシートに保存されます。 他の周囲の核のためにと遺伝子型あたりの筋線維の選択された数の同じ手順を繰り返します。 スプレッドシートファイルにエクスポートされたデータを使用して、以下の式を使用して筋肉のすべてのM個の平均最短距離（DのAVE）を計算します 。 OAD / 53821 / 53821eq1.jpg "/> Diはiは0からNまで変化し、Nは筋肉ごとに分析した核の数で与えられた核iに対する隣接核への最短距離です。 JへJ = 0の値の総和は、= mは分析筋のMの数を示します。 また、使用 最近傍核への平均距離を推定するスポット至近距離にスポット作成ウィザードとスポット。このために、Matlabの拡張モジュールが必要とされます。 アリーナ、3Dボリューム画像上の1つの特定の画像をダブルクリックして、表示​​領域に表示されます。オブジェクトの作成アイコンをクリックし、新しいスポットを追加オブジェクトツールバーから。 オブジェクトのプロパティエリアでの作成ウィザードで、オプションをスキップ自動作成、編集手動]をクリックします。 ラミンまたは核を表示するための核マーカーチャネルのいずれかを選択します。 LEF Shiftキーを押しながらクリック画像内の特定の筋肉の全ての核にトンのマウスボタン。すべての核上のスポットが表示されます。 オブジェクトのプロパティエリアの[ツール]タブの下にリストされているスポット至近距離にスポットを選択します。結果モードとMatlabの窓の下でスポットの統計を選択して表示されます。 [統計]タブの下で、詳細、その後、特定の値を選択します。 Distminをクリックし、すべての核の最小距離の値が表示されます。 スプレッドシートファイルにデータをエクスポートし、筋肉あたりのこれらの距離の平均値を計算します。与えられた遺伝子型のすべての筋肉のための手順を繰り返します。 7. ショウジョウバエ幼虫の体壁の筋肉内核の形状を決定しますこの分析のため、ラミンと核を可視化するための核マーカーで染色体壁筋の共焦点画像を使用しています。 筋核の形状を評価するために、測定球形（SURの比として定義されます顔核の表面積に与えられた核と同じ体積の球の面積）または楕円（長球/扁平楕円とスフェロイドを区別する）。 前述のように画像を開きます。オブジェクトツールバーのアイコンをクリックして新しいサーフェスを追加 。 オブジェクトプロパティエリアに表示されます作成ウィザードでは、核を表示するには、ソースチャンネルとして核マーカー染色を選択します。 閾値としてオプション絶対強度を設定します。核のほとんどが閾値曲線上の値を変更することにより、滑らかで、過負荷になっていないレンダリングを示していることを確認してください。同時に、同じ曲線を使用して、任意の核に穴の存在または不完全なマスクを避けます。 使用 表面レンダリングの任意のノイズを排除するFilterツール。新しく作成された表面層、スプリットの編集タブの下で、または正しく再されている核の表面をマージndered。 スプレッドシートファイルにエクスポート[統計]タブで入手可能である表面レンダリング核の楕円率と真球度の値。 円形度（C）はCのように定義される代わりに、核の真円度を測定するためにImageJのまたはフィジーソフトウェアを使用 。ゼロに近づく値はますます細長い形状を示している一方の値が完全な円を表します。 メニュー画像>スタック> Zプロジェクトからのzスタックの最大強度の投影を作成します。最大強度に投影タイプを設定します。 チャンネルを分割し、核マーカーチャネルを選択します。 メインメニューから、[画像]を選択>>しきい値を調整します。 セグメント強度閾値を調整することにより、核。近くの核は、単一のユニットとしてセグメント化されている場合は、核を切断する工程>バイナリ>流域ツールをクリックしてください。 メインメニューから、[編集]> [S]を選択選挙>選択範囲を作成します。 >ツール> ROI Managerを分析メニューをクリックすることで、ROI Managerに、選択したすべてのROIを追加します。 ROIマネージャウィンドウで[追加]をクリックします。同じウィンドウ内で[その他]> [分割]を選択します。 分析>セット測定における形状記述子を選択します。 ROIマネージャウィンドウでタブをクリックします 測定します。これは、選択したすべての核の真円度値のリストが表示されます。 また、核の体積を測定サブセクション7.3から7.7に記載されているように核マーカー染色チャネルを使用してサーフェス作成ウィザードに従います。 特定のタンパク質の核内局在化を評価するために、 ショウジョウバエの幼虫ボディ壁筋肉内の選択された核の8 3Dボリュームレンダリング核マーカーとし、ラミンとDVAPに特異的な抗体で染色した体壁の筋肉を報告使用共焦点画像。 ソフトウェアおよびSELを開始することによって画像を開きます。電気ショック療法を分析しようとする特定の核。これは、メインメニューの編集>作物3Dを選択することによって行うことができます。 サブセクション7.3から7.7に記載されているようにラミンチャネルを使用してサーフェス作成ウィザードに従ってください。 表面が作成されると、オブジェクトのプロパティエリアで[編集]をクリックし、核の内部の信号を分離するためにすべてのマスクを選択します。これは、新しいウィンドウを作成します。 チャンネルを選択ドロップダウンメニューからDVAP信号を選択します。ゼロに表面の外でオプションセットのボクセルをクリックすることで、核の内側DVAP免疫反応性の信号を選択します。新しいマスクされたチャネルが作成され、選択のための表示調整ウィンドウで利用可能です。 核内部の信号の存在を可視化するためには、追加アイコンを新しいクリッピング平面をクリックすることで、輪郭面を作成しますオブジェクトツールバーから。 対話的クリッピングの角度を調整飛行機や核内部の信号の分布を可視化する立場。