In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.
The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.
Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.
Zebrafish estão emergindo como uma poderosa ferramenta para o estudo de 2,29 doença neuromuscular. Até à data, o sistema de peixe-zebra foi utilizado para validar causadores de doenças musculares nova mutações 16,17,30, elucidar novos patomecanismos 18, e potencialmente identificar novas drogas terapêuticas 12,24. Estes esforços coletivos estabeleceram a utilidade do peixe-zebra para modelar doenças neuromusculares humanas. No entanto, apesar dos avanços feitos com modelos de peixe-zebra e mamíferos, há opções limitadas de tratamento para pacientes dentro do amplo espectro de condições neuromusculares. Portanto, existe uma grande demanda para o desenvolvimento de terapia para esse grupo de doenças devastadoras. Em paralelo a essa demanda por terapêutica é a correspondente necessidade de inovação experimental em curso, bem como uma análise rigorosa para verificar novos modelos animais e estratégias terapêuticas putativos.
Análise EBD é comumente usado em modelos de ratos paratecido estudo e danos celulares no cérebro, coração, músculo esquelético e 27,31. Mais notavelmente, EBD é amplamente utilizado em modelos de ratos com vários subtipos de distrofia muscular para mostrar a gravidade da membrana muscular instabilidade e danificar 8. O uso de CAE para revelar danos membrana muscular é um parâmetro de suporte que estabelece semelhanças entre o modelo animal para o estado de doença humana 9. O poder da EBD no rato levou vários laboratórios, inclusive o nosso, para desenvolver e aplicar EBD para modelos de peixe-zebra de doença neuromuscular. Devido à aplicabilidade da análise EBD, esta técnica está ativamente sendo implementadas para corroborar os modelos de peixe-zebra para o estado de doença humana 11,15,22,24,32. Larvas com as membranas musculares danificadas terá captação EBD e fluorescência vermelha, portanto, dentro de fibras musculares. A fluorescência observada no espaço entre as fibras, mas não nas fibras musculares individuais podem também ser informativo de fibras destacados do porão em t membranaele ausência de dano à membrana, fornecendo detalhes úteis de diagnóstico. Análise EBD tem potencial de aplicação para além validação do modelo animal. Os esforços do nosso laboratório demonstraram recentemente que a análise EBD é benéfica na validação de medicamentos terapêuticos potencialmente novos 24. Determinar se os potenciais tratamentos terapêuticos reduzir ou abolir a captação EBD em modelos de doenças neuromusculares podem significar ação terapêutica relevante 8. Este tipo de análise pode ajudar a estabelecer o mecanismo (s) de terapêuticas e expande a aplicação da análise EBD.
Tal como acontece com muitas técnicas, análise EBD tem muitos cuidados a serem observados durante a concepção e prática experimental. Por exemplo, pode ser um desafio para identificar o CCV devido ao espessamento do tecido com a idade. Além disso, é fácil de danificar larvas em preparação antes e durante a injecção do pericárdio, reduzindo a contagem experimentais e aumentando a necessidade de preparar um grande número de larvas.Além disso, os danos físicos causados ao larvas durante o manuseio e de injecção pode resultar em falsos positivos como músculo danificado pode levar até EBD. A fim de ultrapassar alguns destes obstáculos, descrevemos uma estratégia de co-injecção neste artigo de vídeo que permite a identificação fácil e fiável das larvas com infusão de corante sucesso imediatamente após a injecção e antes da análise subsequente. O FITC-dextrano controlos co-injecção para a injecção bem sucedido, permitindo a confirmação de CAE na vasculatura antes da sua absorção pelas fibras musculares. Isto pode ser particularmente útil como EBD fluorescência torna-se altamente difusa em larvas após várias horas, se não recolhidos nas fibras musculares; como tal, pode ser difícil de detectar. Além disso, a falta de CCV e injectando EBD na gema ou cavidade corporal pode, após a incubação, resultam em fluorescência vermelha difusa semelhante para controlar embriões, ainda com a probabilidade reduzida de absorção pelas fibras musculares danificadas. Coletivamente, estas cavernaats sugerem injeção EBD requer paciência e prática para alcançar resultados consistentes e confiáveis.
Ao todo, nós descrevemos um método prático e simples para realizar a análise EBD em larvas do peixe. Até à data, a utilização de peixe-zebra como um sistema modelo, especialmente como um modelo da doença humana, tem vindo a expandir-se rapidamente. Esta expansão é parcialmente devido ao contínuo desenvolvimento e modificação de técnicas experimentais que melhoram sobre as vantagens atuais do sistema peixe-zebra. A técnica de injeção EBD fornece uma ferramenta adicional e poderosa para arsenal do pesquisador para a validação e estudo de modelos de doenças músculo de peixe-zebra. A implementação em curso e modificação desta técnica tem o potencial de ajudar a descobrir novas estratégias terapêuticas, bem como mecanismos que causam doenças.
The authors have nothing to disclose.
Queremos agradecer Trent Waugh para a sua assistência técnica. Reconhecemos também o Departamento de Pediatria do Hospital for Sick Children e cura da distrofia muscular congênita (DMC) para seu financiamento generoso para este projeto.
Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |