Summary

Enriquecimiento de la célula automatizada de citomegalovirus células T específicas para aplicaciones clínicas utilizando el Sistema de citoquinas de captura

Published: October 05, 2015
doi:

Summary

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Abstract

La transferencia adoptiva de células T de patógenos específicos se puede utilizar para prevenir y tratar las infecciones oportunistas como citomegalovirus (CMV), la infección se producen después de un trasplante hematopoyético alogénico de células madre. Las células T-virales específicos de donantes alogénicos, incluidos los donantes de terceros, se pueden propagar ex vivo en el cumplimiento de las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP), que emplean a rondas repetidas de estimulación antígeno impulsado para propagar selectivamente las células T deseados. La identificación y aislamiento de células T específicas de antígeno también pueden llevarse a cabo basándose en el sistema de captura de citoquinas de las células T que han sido activadas para secretar interferón gamma (IFN-γ). Sin embargo, la aplicación humano generalizado del sistema de captura de citoquinas (CCS) para ayudar a restaurar la inmunidad ha sido limitado como el proceso de producción es mucho tiempo y requiere un operador experto. El desarrollo de un dispositivo de enriquecimiento celular de segunda generación, como CliniMACs Prodigy ahorapermite a los investigadores a generar células T-virales específicos utilizando un sistema automatizado menos, mano de obra intensiva. Este dispositivo separa magnéticamente etiquetados células a partir de células no marcadas que utilizan la tecnología de células activadas por la clasificación magnética para generar productos clínica de grado, se ha diseñado como un sistema cerrado y se puede acceder y operar en la mesa de trabajo. Se demuestra el funcionamiento de este nuevo dispositivo de enriquecimiento de células automatizado para la fabricación de células T-pp65 de CMV específica obtenidas a partir de un producto de aféresis de estado estacionario obtenida de un donante seropositivo CMV. Estas células T aisladas pueden ser infundidas directamente en un paciente bajo supervisión reglamentaria institucional y federal. Todos los pasos de procesamiento de bio incluyendo la eliminación de las células rojas de la sangre, la estimulación de las células T, la separación de las células T específicas de antígeno, purificación y lavado están completamente automatizados. Los dispositivos tales como esta plantean la posibilidad de que las células T para aplicación humana pueden ser fabricados fuera de las buenas prácticas de fabricación dedicada (GMP) Las instalaciones y en su lugar se produzcan en instalaciones bancarias de sangre donde el personal puede supervisar protocolos automatizados para producir varios productos.

Introduction

Trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) 1 se puede combinar con la terapia adoptiva de células T para mejorar el efecto injerto contra tumor y para proporcionar inmunidad frente a infecciones oportunistas 2. Generación de células T derivadas del donante de antígenos específicos para perfusión ha requerido históricamente personal calificado y uso de instalaciones especializadas que son GMP. La entrega de tales células T ha dado como resultado en la resolución de infecciones oportunistas 3, así como el tratamiento de la neoplasia maligna subyacente 4. Recientemente, los investigadores han demostrado que la transferencia adoptiva de tan sólo unos pocos miles de células T específicas del virus (~ 1 x 10 4 a 2,5 x 10 5 células / kg destinatario de peso corporal) puede tratar con éxito las infecciones por CMV oportunistas después de TCMH alogénico 5-9. Un número limitado de instalaciones GMP con los requisitos de fabricación expertos asociados y el alto costo asociado con la producción de células tiene, sin embargo, restracceso de los pacientes igido de terapias prometedoras de células T 10. Un enfoque para el aislamiento de células T específicas de antígeno se basa en los CCS utilizando un reactivo bi-específico para reconocer CD45 y IFN-γ. Como se muestra, esta metodología se puede utilizar para generar células T específicos de CMV clínico grado que emplean un dispositivo de CCS enriquecimiento de células automatizado (Figura 1B).

Las células T-CMV específicos se generan mediante la incubación de péptidos solapantes de antígeno pp65 de CMV con células leukapheresis totales nucleares (CNC) de donantes CMV-seropositivos. Estos péptidos, que se muestran en el contexto de antígeno leucocitario humano (HLA), activan las células T-pp65 de CMV específica dentro de la TNC para secretar IFN-γ. Estas células T pueden ser "capturados" y magnéticamente separados. El funcionamiento del dispositivo de enriquecimiento de células de primera generación (Figura 1A) requiere personal especializado en el cultivo de células bajo condiciones GMP, y la coordinación de personal para llevar a cabo las múltiples sPTE necesarias para generar un producto "capturado".

El procedimiento normalmente requiere de 10 a 12 horas de funcionamiento continuo, y por lo tanto el personal probablemente necesitan trabajar más de dos turnos en las instalaciones de GMP. Estas limitaciones están ahora obvian por la aplicación de un dispositivo de segunda generación (mostrado en la Figura 1B). Este dispositivo se compromete enriquecimiento magnética, similar al dispositivo de primera generación, pero automatiza otros aspectos de la CCS en un enfoque unbreached. Esto reduce significativamente la carga sobre el equipo de GMP ya que la mayoría de los pasos se puede lograr sin supervisión por parte del personal. Además, puesto que el dispositivo funciona como un sistema cerrado, las células T específicas de antígeno pueden ser capturadas y procesadas en la mesa de trabajo, excepto las etapas implicadas en el aislamiento leucoféresis y preparación de materiales antes de iniciar el instrumento. Los detalles de la instrumentación completa y la funcionalidad de este dispositivo de enriquecimiento celular de segunda generación han sido pubcido 11.

A continuación, describimos los pasos para enriquecer las células T-pp65 de CMV específica de un producto de aféresis en estado estacionario utilizando el sistema CCS enriquecimiento de células automatizado. Una vez aislado, estas células T específicos de CMV se pueden infundir inmediatamente en un paciente.

Protocol

1. Preparación de los materiales bajo condiciones estériles (ver Materiales y Equipos Tabla) Preparar 3 L de tampón de PBS / EDTA suplementado con albúmina de suero humano (HSA) a una concentración final de 0,5% (w / v). Preparar 1 L bolsa de solución de cloruro sódico de grado clínico 0,9% (NaCl) y 2 L de medio de cultivo celular GMP grado. Preparar 60 nmol de CMV específica cóctel de antígeno peptídico mediante la reconstitución de un vial de CMV pp65 con 8 ml de agua estér…

Representative Results

En este estudio, se utilizó una célula automatizado enriquecimiento Sistema CCS para la producción automatizada de las células T-pp65 de CMV específica. Las células T-CMV específicos fueron enriquecidos a partir de tres productos de células de aféresis. El producto de aféresis en estado estacionario se cosechó más de 2 horas de un donante CMV-seropositivos y generó 10 10 células nucleares totales (CNC). 10 9 TNC se activa entonces con péptidos derivados de pp65 de CMV (60 nmol) duran…

Discussion

Terapia adoptiva de células T ha surgido como una opción viable para el tratamiento de neoplasias malignas de células B 4. Su potencial terapéutico depende de la infusión el número deseado de células T específicas de antígeno diana que carecen de la senescencia replicativa 2. Esto se puede lograr mediante la clasificación de una población pura de células T específicas de antígeno de las células T expandidas de acuerdo con buenas prácticas de fabricación actuales. Dos procedimientos…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Miltenyi Biotec, Germany for providing reagents and CliniMACS Prodigy equipment for evaluation studies. We thank George T. McNamara (Pediatric department, MD Anderson Cancer Center) for proof reading the manuscript. Grant support: Cancer Center Core Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303; CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); Burroughs Wellcome Fund; Cancer Prevention and Research Institute of Texas; CLL Global Research Foundation; Estate of Noelan L. Bibler; Gillson Longenbaugh Foundation; Harry T. Mangurian, Jr., Fund for Leukemia Immunotherapy; Institute of Personalized Cancer Therapy; Leukemia and Lymphoma Society; Lymphoma Research Foundation; MDACC’s Sister Institution Network Fund; Miller Foundation; Mr. Herb Simons; Mr. and Mrs. Joe H. Scales; Mr. Thomas Scott; National Foundation for Cancer Research; Pediatric Cancer Research Foundation; William Lawrence and Blanche Hughes Children’s Foundation.

Materials

CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag Miltenyi Biotec GmbH 700-29
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 Miltenyi Biotec GmbH 130-097-182
5 L waste bag Miltenyi Biotec GmbH 110-004-067
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) Miltenyi Biotec GmbH 279-01
Albumin (Human) 25%  Grifols 58516-5216-2
Luer/Spike Interconnector Miltenyi Biotec GmbH 130-018-701
0.9 % NaCl Solution (1 L) Miltenyi Biotec GmbH
MACS GMP PepTivator HCMV pp65 Miltenyi Biotec GmbH 170-076-109
Water for injections Hospira, inc, Lake Forest, IL NDC-0409-4887-10
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm  Millipore SLGV033RB
TexMACS GMP Medium 2 L bag Miltenyi Biotec GmbH 170-076-306
Transfer Bag, 150 mL (for cellular starting material) Miltenyi Biotec GmbH 130-018-301
CryoMACS Freezing Bag 50 Miltenyi Biotec GmbH 200-074-400
60 mL Syringes, sterile BD, Laagstraat, Temse, Belgium 309653
CMV sero positive apheresis product Key Biologics, LLC, Memphis
Flow Cytometry Materials Manufacturer Catalog number
AB Serum, GemCell Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA 100-512
CD3-FITC Miltenyi Biotec GmbH 130-080-401
CD4-APC Miltenyi Biotec GmbH 130-098-033
CD8-APC-Vio770 Miltenyi Biotec GmbH 130-098-065
CD14-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-072
CD20-PerCP Miltenyi Biotec GmbH 130-098-077
CD45-VioBlue Miltenyi Biotec GmbH 130-098-136
aIFN-γ-PE, human Miltenyi Biotec GmbH 130-097-940
CD3-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-091-374
Propidium Iodide Solution (100 µg/mL) Miltenyi Biotec GmbH 130-093-233
Equipment Manufacturer Catalog Number
CliniMACS Prodigy Device  Miltenyi Biotec GmbH 200-075-301
Software V1.0.0.RC
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec GmbH 130-096-343
Software 2.4
Centrifuge 5415R  Eppendorf AG 22331
Cellometer K2 Nexelom Bioscience, Lawrence, MA LB-001-0016
Sterile tubing welder SCDIIB Terumo Medical Corp., Elkton, MA 7811

Referenzen

  1. Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst’s Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
  2. Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
  3. Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
  4. Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
  5. Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), 55-59 (2014).
  6. Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
  7. Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
  8. Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
  9. Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
  10. Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
  11. Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
  12. Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
  13. Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
  14. Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
  15. Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
  16. Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
  17. Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Kumaresan, P., Figliola, M., Moyes, J. S., Huls, M. H., Tewari, P., Shpall, E. J., Champlin, R., Cooper, L. J. Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System. J. Vis. Exp. (104), e52808, doi:10.3791/52808 (2015).

View Video