Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

NOT: tanımların listesi için ek malzemeler bölüm S1 bakın. USEPA Yöntem 1615 ile ilişkili QA prosedürleri ek malzemeler bölümünde S2 açıklanmıştır. 1. Filtre Elüsyon Prosedürü Birinci akıtmada tamponlu% 1.5 sığır özü, pH 9.0, 500 ml yerleştirin dereceli bir silindire, oda sıcaklığına kadar ılıtıldı. Filtre kartuşu konut açın ve tamamen elektropozitif filtreyi kapsayacak şekilde sığır özü yeterli miktarda ekleyin. Filtre gövdesi kapağını değiştirin ve steril bir behere kalan sığır özü dökün. temas süresi 1 dakika sonra, bir basınç kabı veya peristaltik pompa kullanılarak yavaş yavaş filtre ile steril bir beherde kalan birlikte gövde sığır özü solüsyonu geçirir. 2 L'lik bir cam kabın içine eluat toplayın. İkinci elüsyon Tekrarlayın tamponlu% 1.5 sığır özü ilave 500 ml kullanılarak 1.1 AdımlarıAncak 15 dakika Adım 1.1.2 de temas süresini artırır. Birinci akıtmada o ihtiva eden 2 L'lik bir kap, ikinci elüsyon sığır eti ekstresi ekleyin. behere steril bir karıştırma çubuğu ilave edin. 2. Organik Flokülasyonu Konsantrasyon Prosedürü en az 5 dakika boyunca 0,525% sodyum hipoklorit ile kombinasyonu tipi pH elektrodu sterilize edin. Steril dH 2 O ile elektrot durulayın ve sonra 0.05 M sodyum tiyosülfat ile dechlorinate. pH 4 ve 7 standartlarını kullanarak pH metre kalibre. bir heyecan plaka üzerinde eluatın içeren behere koyun. plaka açın ve bir girdap oluşana kadar karıştırma hızını artırmak. yavaş yavaş eluata 1.2 M HCl damla damla ilave edilerek 3.5 ± 0.1 eluat pH ayarlayın. Hızlı ekleme virüsü inaktive çünkü HCI damla damla ekleyin. Bir çökelti oluşmaya başlar Bu süre boyunca elüat parçalı hale gelir. Karıştırma spe azaltmakDaha sonra yavaş karışmasına Ed ve 30 dakika için oda sıcaklığında 3.5 ± 0.1 de eluat pH'sini izlenmesi ve bakımı ve devam eder. 4 ° C'de 2,500 x g'de 15 dakika boyunca çökelen sığır özü bir veya daha fazla santrifüj şişelerine süspansiyon ve santrifüj dökün. santrifüj ve her iki aspirat şişeleri kaldırmak veya yavaş topak haline çökelti kaybını önlemek için süpernatant süzün. süpernatant atın. NOT: çökelti miktarı ve kalitesi sığır özü sürü arasında önemli farklılıklar olabilir. Diğer birçok o güçlükle erirken bazı sürü üretilen çökelti hızla eriyecektir. çökeltiyi ihtiva eden bir santrfuj şişesine 0.15 M sodyum fosfat, 30 ml ekleyin. 0.15 M sodyum fosfat, 5 dakika içinde çözülür sığır özü partiden çökeltiler için pH 9.0 kullanın. Çökelti tamamen eritilir sonra 10 dakika süre ile karıştırılır ve daha sonra 2.7 aşamasından hemen gidin. Diğer tüm çökeltiler için 0.15 M sodyum fosfat, pH 7.0-7.5 kullanın. , Ya da daha zor çökeltiler erimesi için 10-15 dakika karıştırın orbital bir karıştırıcı üzerinde 160 rpm'de çalkalanarak çökelti, bir pipet ile karıştırılır sırasında tekrar tekrar yukarı ve aşağı çözeltisi çizerek, steril bir spatula ile ayırmak, veya bu prosedürlerin bir kombinasyonu ile. Not: birden fazla santrifüj şişesi kullanırken, sodyum fosfat az 30 ml kullanılarak çökeltiler birleştirmek ve daha sonra, bir şişe ya da kap içine çökeltiler birleştirildikten sonra şişe durulama 30 ml geri kalan kısmı kullanır. Birleştirilen çökelti düz tabanlı bir santrfuj şişesine ise, şişeye bir karıştırma çubuğu ilave edin. 2.6.5 Adım gidin. Birleştirilen Çökelti konik bir tabana sahip bir santrfuj şişesine ise, küçük bir cam beher içine aktarın ve beher bir karıştırma çubuğu ilave edin. Bir manyetik karıştırıcı üzerine şişe veya behere koyun ve pr kadar karıştırınecipitate tamamen çözülene. 0.525% sodyum hipoklorit ile bir kombinasyon tipi pH elektrodu yeniden sterilize ve Aşama 2.1'de tarif edildiği gibi 0.05 M sodyum tiyosülfat ile dechlorinate. pH 7 ve 10 standartlar kullanılarak pH metre kalibre. Yavaş yavaş 1 M NaOH ile 9.0'a tamamen çözünmüş çökelti pH oranını ayarlamak ve daha sonra 10 dakika boyunca karıştırılmıştır. karıştırma çubuğu çıkarın ve 4,000-10,000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca çözülmüştür çökelti santrifüj. Dikkatlice pelet bozmadan bir cam behere süpernatant dökün. beher bir karıştırma çubuğu ekleyin ve pelet atın. Bir manyetik karıştırıcı üzerine behere koyun ve çözüm karıştırın. 7,0-7,5 pH ayarlamak için akıllıca 1.2 M HCI damla ekleyin. Filtre% 1.5 sığır özü, 15 ml, 0.05 M glisin, pH 7.0-7.5 ile önceden tedavi edilmiş bir ön filtre ihtiva eden bir sterilizasyon filtresi yardımıyla geçirilerek süpernatant sterilize edin. Deney Örnek Volume (S) hesaplamaları: Kullanım Denklem 1, Lab Müstahkem Boş ve Boş Lab reaktifi dışındaki tüm test numuneleri için S hesaplamak için denklem 1 D (Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi) Yeraltı 500 L olduğu, TSV (Toplam Örneklem Hacmi) laboratuvar tarafından alınan 5-inç elektropozitif kartuş filtreden geçirilir alan numune hacmi ve FCSV (Final Konsantre Örnek Hacmi) Adım 2.10 filtrasyon aşağıdaki birimdir. Bir örnek tamamlayıcı malzemeler Bölüm S4.1 gösterilmiştir. Ve Boş Lab Reaktif (LRB; yani reaktif dereceli su kullanarak negatif kalite kontrol) 0.3 ile FCSV çarpılarak; Blank Lab Müstahkem (yani seribaşı reaktif dereceli su kullanılarak bir pozitif kalite kontrol LFB) için S hesaplayın. thre içine FCSV BölE alınan örnekler. 1.04 kat Testi Örnek Hacmi eşit bir hacmi ile alınan örnekler 1 ve 2 hazırlayın. ; Veya altında -70 ° C, toplam kültürlenebilir virüs tahlili (alt örnek 1, Adım 4) kullanılarak analiz veya 24 saat içinde (gösterilmemiştir) moleküler deneyleri için işlenemez eğer bu Alt-numûnelerin Freeze aksi halde, 4 ° C'de tutun. veya altında kalan hacmi (alt örnek 3) Freeze -70 ° C. 10 ile S bölerek Aşı Volume hesaplayın. 3. Toplam kültürlenebilir virüs Quantal Deneyi NOT: Tüm adımlar her zaman hücre tek tabaka rahatsız etmemek için dikkatli bir şekilde çözüm eklemek için. Durusu veya 3-6 gün sonra bölme de BGM hücrelerinin bir tek tabaka içeren test gemilerden aspirat medya ve sonra kaldırılır medyaya eşit dengeli tuz çözeltisi hacmi ekleyin. Durusu veya hücre kültürü te gelen dengeli tuz çözeltisi aspirest gemiler kullanılan ve daha sonra hücre kültürü testi damarları aşılamak olan Toplam kültürlenebilir virüs quantal tahlil kontrolleri (ek malzemeler bölüm S2.4) ile birlikte Aşı Cilt eşit alt örnek 1 hacminde her test numunesi için 10 test damarları aşılamak. (LFSM, yani, tohumlanmış sulu ortam örneği) LFB ve Lab Kuvvetlendirilmiş Örnek matris için bir seyreltici olarak alt örnek 3 ve 0.15 M sodyum fosfat, pH 7.0-7.5 kullanılarak 5-, 25- ve 125-kat seyreltiler hazırlanır. seyreltileri yapmak için bir yöntem örneği, ek malzemeler bölümü S3 verilmiştir. Aşama 3.2.1 içinde seyreltilmemiş alt örnek 1 ile aşılanmış kaplara ek olarak, her bir test kabına bir inokülüm hacimde kullanılarak her bir inceltilmiş serileri için 10 yıkanmıştır hücre kültür testi damarları inoküle. inkübasyon 14 gün sonra 10 tekrarlı CPE vardır (Adım 3.2.2 aşılandı dışındaki) Adım 3.2.1 herhangi bir test örneği için, önceden (Adım 3.3)alt örnek 3. 5-, 25- ve 125- ve 625-kat seyreltme pare inoküle 10 toplam kültürlenebilir virüs quantal yeni bir dizi ile birlikte her bir test gemide bir Aşı Volume kullanarak her seyreltme serisi için hücre kültürü testi gemileri yıkanır tahlil kontrolleri (ek malzemeler bölüm S2.4). ileri ve geri damarları eğerek hücre mono tabakaları yüzeyi üzerinde inokulum dağıtın. 1-5 titreşimler / dakika ya da mevcut olan herhangi bir virüs hücrelere tutunmasını sağlamak için kapların her 15-20 dakikada bir sallanan mekanik sallanan bir platform üzerinde 80-120 dakika için oda sıcaklığında test kapları inkübe edin. önceden ısıtılmış bakım orta ekleyin ve sonra 36.5 ± 1 ° C'de deney gemileri kuluçkaya yatmaktadır. ayarlanmış bir dondurucuya ≥75% CPE gösterir herhangi bir test gemiler gün 14. Transferi kadar onları her 2-3 günde incelemek sonra ilk 3 gün günde bir mikroskop kullanılarak her test kabında CPE görünüm için bakın ve ya-70 ° C'nin altında ° C. veya altında kalan tüm kültürleri ve toplam kültürlenebilir virüs quantal tahlil kontrolleri Freeze -70 ° C son gününde gemileri inceledikten sonra. tüm kültürleri çözülme ve 0.2 mikron sterilizasyon filtresi yardımıyla her CPE-pozitif test kabından orta ≥15% filtre. Belirtilen hacim 1,500-18,000 x g'de 10 dakika süre ile tıkanması, santrifüj, filtre içinden geçerek orta geçirilir ve filtrasyona 4 ° C önceden edilemezse. Yıkanmış BGM testi gemileri kullanarak tüm 1. geçiş testi gemilerin ikinci geçişini gerçekleştirin. Tüm negatif test damarlardan ve olumlu damarlardan süzülmüş ortamdan çözülmüş ortamın% 10 temsil eden bir aşılama hacmi ile yeni test damarları aşılamak. Tekrarlayın 3.2.4-3.4.3 adımları, ancak adım 3.3 tarif edildiği gibi 2 nd 1 st geçit üzerinde olumsuz ve olumlu oldu herhangi bir test gemi dondurmak. Bir 3. geçmek gerçekleştirinYalnızca negatif tahlil kontrolleri ve 2. pasajda 1. geçişi sırasında negatif ve pozitif hücre kültürleri kullanılarak 2. geçişi için tarif edildiği gibi yaşı. Onlar 1. ve 2. pasaj ya da her ikisi de CPE gösterdiğinizde CPE 2. pasajda kadar hem 2. ve 3. geçitleri oluşmaz durumunda, virüs pozitif olarak bireysel test damarları belirleyin. Tüm test numunelerinin virüs titreleri hesaplamak için Tablo S2 gösterildiği gibi ayarlanan varsayılan program ayarları ile USEPA En Muhtemel Sayı Hesaplama kullanın. Giriş MPN / ml değeri (M mL) ve üst (CL UML) ve alt (CL lmL)% 95 güven sınırları / ml değerlerini belirlemek için hesap makinesi içine her bir test numunesi için adım 3.6 virüs pozitif çoğaltmak testi gemilerin sayısı . ODenklem 2 kullanılarak ilgili test örneğinin EMS / L değeri (M L) btain. denklem 2 M ml Adım 3.7 EMS / ml değeri, S Deneyi Numune Hacmi ve D Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi olduğunu. M ml değeri CL UML değerini ikame ederek üst güven sınırı / L hesaplayın. M ml değeri CL lmL değerini yerine göre alt güven sınırı / L hesaplayın. Bir örnek hesaplama ek malzemeler Bölüm S4.2 gösterilmiştir. 0 / D 1 ≤ olarak Raporu M ml değerleri. Örneğin, yeraltı suyu örnekleri için 0.002 EMS / L (≤ 1/500 L) ≤. Sert her Lab MPN ve% 95 güven sınır değerlerini hesaplamak Boş ve Lab Reİlk S tarafından hesap elde edilen değerler / ml çarpılması ve daha sonra 0.3 ile sonuç bölerek Boş ajan.