엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석
Summary
Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.
Abstract
A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency’s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.
Introduction
장 바이러스는 인간의 장 시스템을 감염 및 분변 – 경구 경로를 통해 전송되는 바이러스의 다양한 그룹입니다. 이 바이러스는 하수 처리장 및 오수 정화조 폐수, 잘못 설계되거나 깨진 정화조, 깨진 하수도, 결합 하수 오버 플로우 및 기타 점과 비점 원 1-4을 통해 표면 및 지상 물을 입력합니다. 수 인성 바이러스의 인간 감염과 질병은 오염 또는 부적절하게 소독 물 소비를 통해 또는 레크리에이션 물 접촉을 통해 발생합니다. 질병 증상이 심한 위장염에 가벼운 포함 할 수있다; 결막염; 열; 상부 호흡 곤란; 수족구 병; 심근염; 무균 성 뇌막염; 뇌염; 마비; 패혈증 5-8, 죽음 9,10.
USEPA 방법 1615 환경 마시는 물에서 감염 장내 바이러스 입자를 측정하는 절차를 제공합니다. 이 물은 포함 할 수 있습니다감염성 및 비 감염성 비리의 혼합물,하지만 전염성 입자는 잠재적 인 건강 위험을 포즈. 감염성 바이러스 입자로 인해 11 ~ 13 존재할 수있는 소독제로 단백질 캡시드의 무결성 인해 자외선 광선 방사선 손상에 핵산 손상의 손실, 환경, 마시는 물에서 시간이 지남에 감염을 잃게됩니다. 상기 방법에서 제공되는 전체 바이러스 배양 절차는 버팔로 녹색 원숭이 신장 (BGM) 세포주에서 세포 변성 효과 (CPE)의 제조에 기초한다. 이 세포주는 검출 된 감염성 바이러스 유형의 범위가 특정 엔테로 15 주로 제한 되더라도 때문에 환경 바이러스학 분야 14,15에서의 광범위한 사용으로 선택되었다. 이 논문의 목적은 다섯 인치 전기 양성 카트리지 필터의 용출, 보조 농도, 총 배양 바이러스의 측정 방법 1615의 절차를 설명하는 것입니다. 의 평가전체적인 방법은 Cashdollar 외. (16)에 대하여 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
USEPA 방법 1615은 규제되지 오염 물질 모니터링 규정의 세 번째 모니터링주기 (UCMR3) 17시 사용하기 위해 개발 주로 지하수에서 바이러스 발생을 측정하기 위해 설계되었다. 그것은 정보 수집 규칙 (ICR) 방법, 15,18와 일반적인 단계의 번호를 공유하지만이 약간의 차이가 있습니다. 모두 가장 가능성이 수 (MPN) 계산에 기초하는 정량와 BGM 세포 단일 층에 CPE를 생산하는 바이러스를 측정하는 계량 적 분석을 사용합니다. 방법 1615은 다양한 물 행렬로부터 바이러스를 농축하는 새로운 전기 양성 필터의 사용을 허용하고 세포 배양 시험 용기의 개수는 20 내지 모두 작은 변화가 전체에있어서 비용 절감 (10)에 희석 당 복제 감소시킨다. 복제 횟수의 감소는 노동력을 줄일 수 있지만, 약간 낮은 검출 한계 초래한다. 지하수는 지표수보다 바이러스의 낮은 농도를 가질 것으로 예상되지만, 19, 20 일분석 시료의 전자 량의 차이에 대한 일부 보상 지표수의 다섯 배이다. 적은 복제의 사용은 대부분의 지표수에 적합 수 있지만 일부는 샘플 희석이 필요합니다.
방법 1615 여러 가지 중요한 단계 및 제한 사항이 있습니다. 쇠고기 추출물은 많은에서 많이 다릅니다. 설명이 보충 자료 섹션 S2.3와 같이 각 많은 바이러스 용출의 효율성과 보조 농도 단계를 통해 바이러스 농도의 용량을 테스트해야합니다. 상기 방법은 BGM 세포 배양에 접종하고, 바이러스 역가를 결정하는 시료의 양을 계산하기위한 정확한 식을 사용한다. 이러한 수식을 엄격하게 준수하지 않을 경우 부정확 한 결과가 생성됩니다. 적절한 무균 기술은 세포 배양을 유지하기 위해 사용되어야한다. 14 일의 배양 기간 동안 곤란을 표시 BGM 비감염 세포 배양 제어 가능성 세포 배양 정비 문제를 나타낸다. 큰 관심은 따해야합니다현의 접종 및 교차 오염을 방지하기 위해 세포 배양 플라스크에 매체 추가와 관련된 단계를 피펫 팅시. 보충 자료 섹션 S2에 기술 된 품질 관리가 엄격하게 따라야합니다. 제 S2는 품질 문제에 대한 문제 해결 조언을 제공합니다.
필터를 전기 양성하는 바이러스 흡착 기본 메커니즘은 필터의 양전하의 강도 및 등전점 관련 바이러스 '음전하의 강도와 21 테스트되는 물의 pH 관련된 전하의 상호 작용이다. 필터로부터 용출은 이러한 상호 작용의 강도에 의해 영향을 받는다. 그들은 바이러스 유형 사이에도 동일한 타입 내 균주 중에서 다르기 때문에 필터로부터 용출이 균일하지 않다. 이 모든 결과는 환경 물에 존재하는 바이러스의 실제 수준을 과소 평가 수 있다는 것을 의미한다. 단일 BGM 세포주의 사용은 바이러스 발생을 과소. 범위주로 polioviruses 및 엔테로 바이러스 B 종의 혈청 형뿐만 아니라 일부 reoviruses 14,15,22에 제한이 셀 라인에서 CPE를 생성 할 수 있습니다 장내 바이러스. 기타 감염성 바이러스 유형이 검출 될 수 없다.
지상 및 시약 등급의 물에서 폴리오 바이러스 복구는 모두 성과 평가 (PE에 대한 USEPA 방법 1615 성능 판정 기준을 충족, 즉, 시작하기 전에 분석의 성능을 평가하는 데 사용됩니다 애널리스트 알 수없는 역가와 시드 시약 등급의 물 샘플 연구) 및 LFB 샘플 (보충 자료 표 S1)의. 배양 절차에 지하수 중 58 % 회수 수돗물 (23, 24)를 사용하여 다른 사용자에 의해보고 된 것과 유사하다. 변동 계수가 100 % (CV) 111 %로 LFB 샘플의 평균 회복도가 PE 샘플에 대해 관찰 된 것보다 더 높은 경우에도있어서 성능 판정 기준을 충족 DURICR을 보내고. ICR은 평균 intralaboratory 회수율이 85 % (상기 ICR PE 데이터베이스에서 게시되지 않은 데이터 이력서 58 131 %)로 36까지 변화하면서 실험실 간 복구는 92 %의 편차 (CV)의 계수가 56 %이었다 의미한다. 높은 회수율 높은 종자 샘플 (1백22퍼센트 42 대)보다 낮은 시드 LFB 샘플에 대한 본 연구에서 관찰되었다. ICR가 계획 될 당시에, 그것은 낮은 시드 값을 수신 PE 샘플은 그 높은 종자를 수용하는 것이 낮은 회복했을 것으로 예상되었다. LFB 샘플 여기 관찰 된 것과 유사한, ICR PE 샘플에 대한 폴리오 복구 시드 값 (CV, 100 %), 54 % (CV 69 %) 및 44 % (CV 71 %) 71 %였다 ≤300 MPN, 300- 각각 1,500 MPN, 및> 1500 MPN.
물 샘플 25 전염성 바이러스를 측정하기위한 많은 방법이있다. 이 방법은 표준화의 정도에 다른 방법에 관하여 중요하다. 표준화, 품질 및 성능 컨트롤이 포함뿐만 아니라,뿐만 아니라 모든 분석 실험실은 동일 방법을 수행하도록 정의 된 볼륨과 수식을 사용합니다. 표준화 없이는 실험실에 걸쳐 결과를 비교하는 것은 곤란하고, 복수의 분석 실험실에서 대규모 연구를 수행 할 때, 따라서 표준화가 필수적이다. 내장 표준화이 방법은 추가로 바이러스 유형 및 세포주를 포함하는 미래에 확장 할 수있다. 연구 방법에 아데노 바이러스를 포함하기 위해 데이터를 제공하는 것.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Beef extract, desiccated powder | BD Bacto | 211520 | |
| Cryogenic tubes | Thermo Fisher | 3775/945373 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| Mechanical rocking platform | Daigger | EF4907G | |
| Orbital shaker | Thermo Fisher | 14-285-729 | |
| Sterilizing filter with prefilter | VWR | 28143-295 | |
| Sterilizing syringe filter | Corning | 431219 | |
| pH Standards | Sigma-Aldrich | 33643, 33646, 33648 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M1018 or M4642 | |
| Leibovitz L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | |
| Sodium bicarbonate, 7.5% | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Trypsin, EDTA | Invitrogen | 25200072 |
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