Bireysel dopamin nöronlarının izolasyon ya da doğrudan veya dolaylı olarak immunohistokimyasal ile ventral tegmental alan lazer yakalama mikrodiseksiyon kullanılarak gösterilmiştir. Kızılötesi lazer kullanarak cam slayt doku izolasyonu ve bir kızılötesi ve morötesi lazer kombinasyonu kullanılarak membran slaytlar arasındaki parametreler tartışılmıştır.
Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM), bir mikroskop lamı üzerine tek tek hücre veya doku kesitlerinin bir doku hassas anatomik bölgelerine konsantre bir popülasyonu izole etmek için kullanılır. Immünohistokimya ile birleştirildiğinde, lcm spesifik bir protein işaretleyiciye dayanan tek tek hücreler türleri izole etmek için kullanılabilir. Burada, lcm tekniği ile doğrudan tirosin hidroksilaz immünohistokimya ile LCM için kullanılanlara bitişik bir bölümü üzerinde dolaylı tirosin hidroksilaz immünohistokimya kullanılarak, ventral tegmental alan bölgesini içeren dopamin nöron izolasyonu için etiketli dopamin sinir hücrelerinin belirli bir nüfus toplanması için bir işlem açıklanmaktadır. Bir kızılötesi (IR) yakalama lazer hem de kullanılan bireysel nöronlar yanı sıra cam slaytlar ve analiz için bir LCM kapağı üzerine ventral tegmental alanı kapalı teşrih. % 100 etanol ve ksilen dokuya tam dehidrasyon kritiktir. İR yakalama lazer kombinasyonu ve ultraviyole (UV) cutting lazer PEN membran slaytları kullanırken bireysel dopamin nöronları veya ventral tegmental alanı izole etmek için kullanılır. Bir PEN membran slayt o, hızlı doku büyük parça topluyor hücreleri yakalama ve toplama daha iyi tutarlılık sunuyor, bir cam slayt üzerinde önemli avantajlara sahiptir slayt doku tamamen çıkarılması dehidratasyon ve sonuçları daha az güvenen. Bir cam slayt doku geniş alanlar çıkarılması mümkün olmasına rağmen, önemli ölçüde daha fazla bir zaman alır ve genellikle arkasında bazı kalıntı doku bırakır. Burada gösterilen veriler, yeterli miktarda ve kalitede RNA kantitatif PCR ölçümleri için de bu prosedürlere göre elde edilebileceğini göstermektedir. RNA ve DNA da geliştirilmiş anatomik ve hücresel çözünürlük yararlanabilir microRNA, protein ve DNA epigenetik değişikliklerin LCM, izolasyon ve ölçümü ile toplanan en sık izole dokudan moleküller ve hücreler olmasına rağmen LCM kullanılarak elde edilmiştir.
Tüm doku hücrelerinin bir heterozigot topluluğundan oluşmaktadır. Bu glial hücreleri (oligodendrositler, mikroglia ve astrositler) çeşitli çevrili çeşitli morfolojik ve / veya nörokimyasal farklı nöron oluşan beyin dokusu için özellikle uygundur. Ek olarak, korteks veya beyin sapı çekirdeklerinin alanlar olarak beyinde farklı bölgeler, belirli bir işleve sahiptir. Analitik teknikler (örneğin Q-PCR, mikrodiziler, RNA, DNA sekanslama proteomik) ile bir araya nedenle, özelliği belirgin bir şekilde çeşitli biyolojik süreçlerin anlaşılmasını artırabilir, hücre ya da çok küçük bir anatomik olarak farklı alanlarının özel popülasyonlarının izole edilmesi için. LCM RNA, mıkroRNA, DNA ve proteinler gibi çeşitli moleküller, daha fazla analiz için çok daha homojen bir kaynak temin eden bir mikroskop lamı üzerine dokusundan çok farklı anatomik alanlar veya belirli hücrelerin izole edilmesi mümkün kılan bir teknolojidir.
t "> LCM ilk tanıtıldı yana, birkaç farklı yaklaşımlar dokudan 1-3 hücreleri microdissect için kullanılmıştır. erken yaklaşımlar bir kızılötesi (IR) lazer ve bir termoplastik film ve olmayan bir kullanarak bir slayt dokuya direkt eki dahil bir tüp içine, bir hücre ya da doku ve toplama ayırmak için lazer kesme bir ultraviyole (UV) ile iletişim yöntemi. Daha sonra, lcm başarılı dokularda ve hücre tiplerinde çeşitli kullanılan gösterilmiştir alt analizi için çeşitli moleküllerinin izole edilmesi ile uyumlu olacak şekilde enzimatik aktivite 1,4-7, RNA, mıkroRNA, DNA ve proteinler de dahil olmak üzere. Burada lcm bir kesme UV lazer ve hücreler ya da doku çevresinde kesme ve sabitlenmesi için bir yakalama kızılötesi lazer kullanan bir LCM sistemi kullanılarak gösterilmiştir LCM kap olarak bulunmuştur. Bu LCM sistemi plastik filme hücreleri bağlayan ve t kaldırır hücre ya da ilgi konusu doku üzerinde bir kapak ile bir plastik film eriyik IR yakalama lazer hem kullanırkapağın kaldırılması ile de doku (Şekil 1). Buna ek olarak, İR lazer ile bir arada, bir UV lazeri cut-out için doku veya sonra kızılötesi lazer (Şekil 2) ile lcm kapağa doku bağlanması ile izole edilmiş bir zar ile kaydıraklar üzerinde monte dokudan çıkar hücreleri mevcuttur. Bu tekniklerin kısa bir bakış, Şekil 1 ve 2'de bulunmaktadır.Ya doğrudan fluoresan immünohistokimya ve belirli bir proteinin ifadesine dayalı bir doku bölgesinin izolasyonu için kullanılır dolaylı immünohistokimya güdümlü tekniği kullanılarak belirli hücreleri izole etmek için bu teknik üzerinde çeşitli varyasyonlar tarif edilmiştir. Spesifik olarak, substantia nigra ve ventral tegmental alan ve taze, dondurulmuş beyin dokusu RNA daha sonra tecrit izolasyondan dopamin sinir hücrelerinin izolasyonu gösterilmiştir. RNA, ölçülen moleküllerin en çok kararsız olduğu için, st (DNA ya da protein ile karşılaştırıldığında)RNA bütünlüğünü korumaya yardımcı olmak için eps dahil ve veri elde RNA miktarı ve kalitesi üzerinde gösterilir.
LCM bir mikroskop lamı ve RNA, mıkroRNA, DNA ve protein daha sonra izolasyon hücre veya doku kesitlerinin bir doku bölgelerin somut popülasyonlarının diseksiyon için güçlü bir tekniktir. Bu tekniklerin duyarlılığı arttırır ve gerekli başlangıç malzemesi miktarı azaltılır gibi mikrodizi, yeni nesil bir RNA dizisi, DNA ve proteomik epigenetik analizi, yüksek verimli teknolojileri kullanılarak analizi ile kombinasyon halinde LCM kullanımı giderek daha yaygın hale gelmektedir 8-12. LCM ile, daha iyi bir anatomik çözünürlüğü için bir örnek elde edilir, ve bu örneklerin alt baş tedbirlerden anlama büyük ölçüde artırılmıştır. LCM ile bir uyarı, ilgi hücreleri ancak zorunlu hücre saf nüfusunun konsantre örneği sağlamasıdır. hassas sınırları komşu doku bazı kirlenme var olacağı anlamına. Ancak, bu teknik ilgi hücreleri konsantre yapardoku ve hücreleri çevreleyen ile ilgili etkilerini en aza indirmek ve ilgi hücreleri üzerinde deneysel etkileri maksimize etmek.
Dolaylı İmmünohistokimya karşı doğrudan
LCM anda RNA sağlam tutarak, izolasyon ve RNA ölçümü için öncelikle kullanılan olduğundan çok önemli bir kriterdir. RNA bütünlüğünü korumak (Şekil 10) RNA düşüren doğrudan doku leke gereğini kaldırır doku diseksiyonu rehberlik dolaylı immünohistokimya kullanımı asıl gerekçesi de budur. Deneysel soru, ancak, bu, dopamin nöronları gibi hücreler, belirli bir popülasyonun izole gerektirdiğinde, doğrudan floresan immünohistokimya gereklidir. Hızlı immünohistokimyasal etiketleme protokolünü kullanarak işlem sırasında RNA bozulmasını en aza indirebilirsiniz. Kısa inkübasyon süreleri, birincil ve ikincil anti-yüksek konsantrasyonlarının kullanımı nedeniyleorganları, yaklaşık 10-20 olan konsantrasyonları 2 saatlik inkübasyon geleneksel immünohistokimya için gerekli olandan daha yüksek kat. Bununla birlikte, uzun inkübasyon sürelerine ihtiyaç durumunda, Brown ve Smith, RNA bozulmasını inhibe eden ve uzun inkübasyon süreleri (20 saat kadar), 13 ile iyi kalitede RNA elde etmek için yüksek tuz tampon kullanılır. Bu yaklaşım, aynı zamanda bir LCM sistemine doku etiketleme ve alma erişim arasında gerekli önemli bir zaman varsa kullanılabilir.
PEN zarın, Silan-hazırlık ve kaplanmamış cam slaytlar – slaytlar seçimi
LCM kaplanmamış cam slaytların kullanımı 14 bildirilmiştir. Bu kaplama yeterince doku kaybı olmadan immünohistokimya için slayt doku ekler ama hala slayt LCM kapaklar doku eki ve kaldırılması için izin verir gibi Laboratuvarımızda, Silan-hazırlık slaytlar, optimal bir seçim olduğu tespit edilmiştir . Kaplamasız cam slaytlar varimmünohistokimyası prosedürü ile bazı doku kaybı gösterdi. Dolaylı immünohistokimyasal kullanılırsa, ancak doku tutma daha az sorun olur. Silan-hazırlık slaytlar kapalı düzgün dehidratasyon, yakalama hücreleri veya dokusu ile ilgili bir sorun olmamıştır. Bu yazıda anlatılan izole nöronların veya beyin bölgelerinde çeşitli yaklaşımların her biri avantajları ve dezavantajları vardır. Bireysel dopamin sinir hücrelerinin izole edilmesi için, silan-preparatif slaytlar kullanımı iyi optik avantajı vardır ve PEN membran slaytlar daha az pahalıdır. Orada yetersiz dehidratasyon (aşağıya bakınız) ve bazı doku slayt üzerinde kalabilir, eğer dezavantaj bazen yakalayan hücreler zor olabilir ki. PEN membranlar slaytlar avantajı IR ve UV lazer lazer kombinasyonu kullanılarak dopamin nöronları tahsil edilecektir sağlar olmasıdır. Cam slaytlar daha dehidratasyon daha az bağımlı olduğu gibi PEN membran slaytlar hücreleri toplamak için Başarısızlık neredeyse hiç oluşur. Bir Ek bir avantaj, kızılötesi lazer ile cam slaytların kapalı nöronlar yakalamak için bir çevreye göre UV lazer daha yakından ilgi nöronların şekle yaklaştıkları için kullanılabilir olmasıdır. Doku bölgeleri izolasyonu için, PEN membran slaytlar üstündür ve ilave maliyet haklı. Membran üzerinde kesip tüm doku tamamen kaldırılması Bu yaklaşım sonuçları, tek başına IR lazer kullanarak ve kalın doku bölümleri toplanabilir doku geniş bir alanı yakalama daha hızlıdır. Ancak kızılötesi lazer kullanarak LCM kapak zarı tamamen tüm doku alanı üzerine erimiş olması gerekir. Ayrıca, doku eksik koleksiyonu tipik ve genellikle birden girişimleri gerektirir. Bu PEN membran slayt doku izole daha uzun sürer rağmen mevcut doku cam slayt veya UV lazer zaten ise, doku çoğu (Şekil 8J) tahsil edilebilir bu uygun bir seçenek olduğunu, mevcut değildir.
ove_content "> Kritik adımlar% 100 etanol inkubasyon en önemli adımlardan biridir. Silan-hazırlık slaytlar hücreleri toplamak için dokusunun tam dehidratasyon gereklidir. Bu nedenle,% 100 etanol inkübasyon çoğunlukla ilişkili kaldırılmaz herhangi bir su, slaytlar hücreleri almak yeteneğini etkiler. Bu sorunu gidermek için, sık sık dehidratasyon etkileyebilir önceki yıkama adımlarından hava veya transfer suyun emilimi% 100 etanol çözümleri değiştirin. Buna ek olarak, moleküler elekler, bir su kontaminasyonu absorbe etmek için kullanılır. LCM sistemi ideal düşük nem koşulları sağlamak için bir nem alıcı ile küçük bir odada yer almalıdır.
İyi karyostat bölümleri düzgün LCM için kritik öneme sahiptir. Bölümler minimize dokuda kıvrımlar düz olması gerekir. LCM kapağı arasındaki mesafeyi artırmak ve t temas engellemek olacaktır dokuda KıvrımlarO doku. Daha sonra, yeterli bir doku üzerine zar kap eritmek için zor olur. Cam slaytlar için, tipik haliyle kesit kalınlığı 6 ve 12 um arasında olması gerekmektedir. Kalın bölümler PEN membran slaytlar ile yakalanabilir.
LCM mikroskop slaytlar çok hassas doku diseksiyonu ve hücreleri yapmak için bir teknik kapasiteye sahiptir. Doku parçaları brüt diseksiyon kıyasla dramatik olarak daha fazla analiz çözünürlüğünü artırır. LCM zaman ve yoğun emek olabilir rağmen, bu kapsamlı eğitim veya uzmanlık ve gerektirmez, diğer yüksek verimli teknolojiler ile birleştiğinde ayrı hücreler veya anatomik bölgeler kullanıldığında, büyük ölçüde biyolojik sürecin anlayışı geliştirmek olabilir.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 – 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Numer | Comments |
Veritas Laser Capture Microdissection System | Life Technologies, Grand Island, NY | Newer model is now sold | |
CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0211 | |
CapSure HS LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0213 | |
PEN Membrane slides | Life Technologies, Grand Island, NY | s4651 | |
Silane prep-slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S4651 | |
95% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7148 | |
100% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
Rnase Free Triton | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8787 | |
Molecular Sieve | EDM Millipore, Billerica, MA | MX1583D | |
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody | EDM Millipore, Billerica, MA | Ab152 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies, Grand Island, NY | A-11008 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2939AA | |
Stratagene MX 3005P | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 401513 | |
Nanodrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ||
Quant-iT RiboGreen | Life Technologies, Grand Island, NY | R11490 | |
RNaseZap | Life Technologies, Grand Island, NY | AM9780 |