הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא אדום ואולטרא-סגול הם דנו.
microdissection ללכוד לייזר (LCM) משמש כדי לבודד אוכלוסייה מרוכזת של תאים בודדים או אזורים אנטומיים מדויקים של רקמה מסעיפי רקמות על שקופיות מיקרוסקופ. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, LCM יכול לשמש כדי לבודד סוגי תאים בודדים המבוססים על סמן חלבון ספציפי. כאן, טכניקת LCM מתוארת לאיסוף אוכלוסייה ספציפית של נוירונים דופמין שכותרתו ישירות עם אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין ובידוד של נוירון דופמין המכיל אזור של אזור tegmental הגחון באמצעות אימונוהיסטוכימיה hydroxylase טירוזין העקיפה על סעיף סמוך לאלה המשמשים לLCM. לייזר ללכוד אינפרא אדום (IR) משמש לשניהם לנתח נוירונים בודדים, כמו גם את אזור tegmental הגחון את שקופיות זכוכית ועל כובע LCM לניתוח. התייבשות מוחלטת של הרקמה עם 100% אתנול וקסילן היא קריטית. השילוב של הלייזר ללכוד IR ואולטרה הסגול cutti (UV)לייזר ng משמש לבודד תאי עצב בודד או דופמין אזור tegmental הגחון בעת שימוש בשקופיות קרום PEN. יש שקופית קרום PEN יתרונות משמעותיים על פני שקופיות זכוכית כפי שהוא מציע עקביות טובה יותר בלכידת ואיסוף תאים, הוא מהיר יותר איסוף חתיכות גדולות של רקמה, היא פחות סומך על התייבשות ותוצאות בהסרת הרקמה מהשקופית מלאה. למרות הסרת האזורים הגדולים של רקמה משקופיות זכוכית אינה ריאלי, זה הרבה יותר זמן רב ולעתים קרובות משאיר כמה רקמות שיורית מאחור. הנתונים שמוצגים כאן להוכיח כי ניתן להשיג RNA בכמות ובאיכות מספקות באמצעות נהלים אלה למדידות PCR כמותי. למרות RNA ו- DNA הם המולקולות הנפוצות ביותר המבודדים מרקמות ותאים שנאספו עם LCM, בידוד ומדידה של microRNA, חלבון ושינויים אפיגנטיים בDNA יכול גם ליהנות מהרזולוציה אנטומיים וסלולרית המשופרות שהושג באמצעות LCM.
כל הרקמה מורכבת מאוכלוסייה הטרוזיגוטיים של תאים. זה רלוונטי במיוחד לרקמת מוח, בהיקף של נוירונים שונים מובחנים מורפולוגית ו / או neurochemically מוקף סוגים שונים של תאי גליה (oligodendrocytes, מיקרוגליה והאסטרוציטים). בנוסף, אזורים שונים במוח, כגון אזורים של גרעיני קליפה או גזע המוח, יש פונקציות ספציפיות. לכן, היכולת לבודד אוכלוסיות ספציפיות של תאים או באזורים שונים מבחינה אנטומית קטנים מאוד, בשילוב עם טכניקות אנליטיות (כלומר, Q-PCR, microarrays, RNA-רצף, ופרוטאומיקה), יכול לשפר במידה ניכרת ההבנה של תהליכים ביולוגיים שונים. LCM הוא טכנולוגיה המספקת את היכולת לבודד אזורים אנטומיים מאוד דיסקרטיים או תאים ספציפיים מהרקמה בשקופית מיקרוסקופ מתן הרבה יותר הומוגנית מקור לניתוח נוסף של מולקולות שונות, כגון RNA, מייקרו-רנ"א, DNA וחלבונים.
t "> מאז LCM הוצג לראשונה, מספר גישות שונות שימשו לmicrodissect תאים מרקמות 1-3. הגישות המוקדמות כללו קובץ מצורף ישיר של רקמה בשקופית באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) וסרט תרמופלסטיים ואי שיטת קשר באמצעות אולטרא-סגול (UV) חיתוך לייזר לנתק תא או רקמה וגבייה לתוך צינור. בהמשך לכך, LCM שמש בהצלחה במגוון רחב של רקמות וסוגי תאים והוצג להיות תואמת עם בידוד של מולקולות שונות לניתוח במורד הזרם כולל RNA, מייקרו-רנ"א, DNA, חלבונים ו, הכולל את הפעילות האנזימטית 1,4-7. הנה LCM מודגם באמצעות מערכת LCM שנעשה שימוש בליזר UV חיתוך וליזר IR לכידה לחיתוך סביב תאים או רקמות וההצמדה ל כובע LCM, בהתאמה. מערכת זו משתמשת בשני LCM הלייזר ללכוד IR כדי להמס סרט פלסטיק על כובע מעל לתא או הרקמה של עניין שמתחבר לתאים סרט הפלסטיק ומסיר אותו מtהוא רקמה עם הסרת הכובע (איור 1). בנוסף, בשילוב עם לייזר IR, לייזר UV נגיש לחתוך מן רקמה או תאים של ריבית מהרקמה רכובה על שקופיות עם קרום מבודד אז על ידי הצמדת הרקמה לכובע LCM באמצעות לייזר IR (איור 2). סקירה קצרה של טכניקות אלה נמצאת באיורים 1 ו -2.כמה וריאציות על טכניקה זו מתוארות לכל אחד בודד תאים ספציפיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה ניאון ישירה וטכניקה מודרכת אימונוהיסטוכימיה עקיפה המשמשת לבידוד של אזור של רקמה המבוסס על הביטוי של חלבון מסוים. באופן ספציפי, הבידוד של נוירונים דופמין מnigra substantia והבידוד של אזור tegmental הגחון והבידוד הבא של RNA מרקמת המוח טרי, קפואה מוצג. כRNA הוא יציב ביותר של מולקולות נמדדות (בהשוואה ל- DNA או חלבון), רח 'eps כדי לעזור לשמור על שלמות RNA כלולים והנתונים המוצגים על הכמות והאיכות של RNA שהושגה.
LCM הוא טכניקה רבת עוצמה לנתיחה של אוכלוסיות של תאים או אזורים של רקמה מסעיפי רקמות בדידות בשקופית מיקרוסקופ והבידוד הבא של RNA, מייקרו-רנ"א, DNA וחלבונים. השימוש בLCM בשילוב עם ניתוח תוך שימוש בטכנולוגיות תפוקה גבוהה כגון microarray, רצף RNA דור הבא, ניתוח אפיגנטיים של DNA ופרוטאומיקה הופך יותר ויותר נפוץ כמו הרגישות של טכניקות אלה משפר את כמות חומר המוצא צורך מופחתת 8-12. עם LCM, רזולוציה אנטומיים טוב יותר מושגת למדגם, וההבנה מצעדים במורד הזרם של דגימות אלה היא מאוד משופרת. אזהרה אחת עם LCM היא שהיא מספקת מדגם מרוכז של התאים של עניין, אך לא בהכרח אוכלוסייה טהורה של תאים. גבולות הדיוק אומר שיהיה כמה זיהום מרקמות סמוכות. עם זאת, טכניקה זו עושה להתרכז התאים של ענייןכדי למזער את השפעות הקשורות לרקמות ותאים ולמקסם את ההשפעות הניסיוניות בתאים של עניין.
ישיר מול אימונוהיסטוכימיה העקיפה
מאז LCM מנוצל כיום בעיקר לבידוד והמדידה של RNA, RNA שמירת שלמותה הוא קריטריון חשוב מאוד. שמירה על שלמות RNA היא הרציונל העיקרי מאחורי השימוש באימונוהיסטוכימיה עקיפה כדי להדריך את נתיחת רקמות אשר מסירה את הצורך להכתים את הרקמה ישירות שיכול לבזות את RNA (איור 10). כאשר השאלה הניסיונית, לעומת זאת, דורשת בידוד של אוכלוסייה ספציפית של תאים, כגון תאי עצב דופמין, נדרש אימונוהיסטוכימיה ניאון ישירה. באמצעות פרוטוקול תיוג אימונוהיסטוכימיה מהיר יכול למזער את ההשפלה של RNA במהלך ההליך. הפעמים דגירה קצרות נובעות מהשימוש בריכוזים גבוהים של אנטי ראשוניים ומשנייםגופים, ריכוזים שסביב 10-20 לקפל גבוהים יותר ממה הוא הכרחי עבור אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית עם דגירה 2 שעות. אם לעומת זאת, פעמים דגירה ארוכות יותר נדרשות, בראון וסמית משמשים מאגרי מלח גבוהים לעכב השפלה RNA ולקבל RNA באיכות טובה עם זמנים ארוכים דגירה (עד 20 שעות) 13. גם גישה זו יכולה לשמש אם יש זמן ניכר הנדרש בין התיוג של הרקמה וגישה להגיע למערכת LCM.
בחירה של שקופיות – קרום PEN, Silane-הכנה ושקופיות זכוכית ללא ציפוי
השימוש בשקופיות זכוכית ללא ציפוי לLCM דווחו 14. במעבדה שלנו, מגלשות Silane-prep כבר מצאו להיות בחירה אופטימלית, כציפוי זה מספיק מצרף את הרקמה לשקופית אימונוהיסטוכימיה ללא אובדן של רקמה אך עדיין מאפשר לצירופה של הרקמה לכובעי LCM והסרת מהשקופית . יש לי שקופיות זכוכית ללא ציפויהראה כמה אובדן רקמה עם הליך אימונוהיסטוכימיה. אם נעשה שימוש באימונוהיסטוכימיה עקיפה, לעומת זאת, שימור רקמה הופך פחות בעיה. עם התייבשות נכונה, תאים או רקמות לכידת הנחה של שקופיות Silane-הכנה לא הייתה בעיה. כל אחת מהגישות השונות לנוירונים בידוד או אזורים במוח המתואר במאמר זה יש יתרונות וחסרונות. לבידוד של נוירונים דופמין הבודדים, השימוש בשקופיות Silane-prep יש את היתרון של אופטיקה טובה יותר ופחות יקר מאשר שקופיות קרום PEN. החסרון הוא שתאים לפעמים לכידה יכולים להיות קשים אם יש התייבשות מספיקה (ראה להלן) וכמה רקמות ניתן להשאיר בשקופית. היתרון של שקופיות קרומי PEN הוא שהשימוש בשילוב של לייזר הלייזר וUV IR מבטיח כי נוירונים דופאמין ייאספו. אי-איסוף תאים משקופיות קרום PEN כמעט אף פעם לא מתרחש, כפי שהוא פחות תלוי בהתייבשות מאשר שקופיות הזכוכית. יתרון נוסף הוא שליזר UV יכול לשמש כדי להתקרב לצורה של תאי העצב של עניין באופן הדוק יותר, בהשוואה למעגל עבור לכידת תאי עצב משל שקופיות זכוכית עם לייזר IR. לבידוד של אזורים של רקמה, שקופיות קרום PEN עדיפות בהרבה ולהצדיק את העלות הנוספת. גישה זו גורמת להסרת כל הרקמה לגזור על הקרום שלם, היא הרבה יותר מהר מאשר לכידת שטח גדול של רקמות באמצעות לייזר IR לבד ויכולים להיות שנאספו קטעי רקמה עבים יותר. רק באמצעות לייזר IR מחייב את קרום כובע LCM הוא נמס לגמרי על אזור הרקמה כולה. בנוסף, אוסף שלם של הרקמה אופייני ודורש בדרך כלל ניסיונות מרובים. למרות שזה לוקח יותר זמן מאשר בידוד רקמה משקופית קרום PEN, אם הרקמה זמינה כבר בשקופית זכוכית או לייזר UV אינו זמין, זה הוא אפשרות מעשית כמו רוב הרקמות ניתן לאסוף (איור 8J).
"> צעדים קריטיים ove_contentIncubations אתנול 100% הם אחד הצעדים החשובים ביותר. על מנת לאסוף תאים משקופיות Silane-הכנה נדרשת התייבשות של הרקמה שלמה. לכן, כל מים לא הוסרו, אשר מזוהה בעיקר עם הדגירה אתנול 100%, ישפיעו על היכולת להרים תאים מהשקופיות. כדי לטפל בבעיה זו, לעתים קרובות לשנות את פתרונות אתנול 100% כספיגה של מים מהאוויר או ההעברה משלבי כביסה קודמות יכול להשפיע על ההתייבשות. בנוסף, מסננות מולקולריות רגילות לספוג כל זיהום מים. מערכת LCM אידיאלית צריכה להיות ממוקמת בחדר קטן עם מסיר לחות כדי לשמור על תנאי לחות נמוכים.
סעיפי cryostat טובים הם קריטיים לLCM הנכון. סעיפים צריכים להיות שטוח עם קפלים ברקמות ממוזערות. מקפל ברקמה יגדיל את המרחק בין כובע LCM ולמנוע ממנו ליצור קשר עם tהוא הרקמה. לאחר מכן הוא הופך להיות קשה כדי להמס את כובע הקרום מספיק על הרקמה. לשקופיות זכוכית, בדרך כלל עובי סעיף צריך להיות בין 6 ל 12 מיקרומטר. ניתן ללכוד קטעים עבים עם שקופיות קרום PEN.
LCM מציע יכולת טכנית לעשות ניתוחים מאוד מדויקים של רקמות ותאים משקופיות מיקרוסקופ. זה מגדיל באופן דרמטי את הרזולוציה של ניתוח נוסף בהשוואה לנתיחת ברוטו של פיסות רקמה. אמנם, LCM יכול להיות זמן ועבודה אינטנסיבית, היא אינה דורשת הכשרה או מומחיות נרחבות ו, כאשר בשילוב עם טכנולוגיות תפוקה גבוהה אחרות, יכול לשפר באופן משמעותי את ההבנה של תהליך ביולוגי כאשר תאים בדידים או אזורים אנטומיים משמשים.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 – 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Numer | Comments |
Veritas Laser Capture Microdissection System | Life Technologies, Grand Island, NY | Newer model is now sold | |
CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0211 | |
CapSure HS LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0213 | |
PEN Membrane slides | Life Technologies, Grand Island, NY | s4651 | |
Silane prep-slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S4651 | |
95% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7148 | |
100% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
Rnase Free Triton | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8787 | |
Molecular Sieve | EDM Millipore, Billerica, MA | MX1583D | |
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody | EDM Millipore, Billerica, MA | Ab152 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies, Grand Island, NY | A-11008 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2939AA | |
Stratagene MX 3005P | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 401513 | |
Nanodrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ||
Quant-iT RiboGreen | Life Technologies, Grand Island, NY | R11490 | |
RNaseZap | Life Technologies, Grand Island, NY | AM9780 |