The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.
1970 के दशक पश्चिमी धब्बा, उपस्थिति और जटिल जैविक नमूने भीतर विशिष्ट प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत का आकलन करने के लिए एक तकनीक के पहले सार्वजनिक रूप से सूचना दी प्रयोग देखा. तब से, पश्चिमी सोख्ता पद्धति आणविक जीव प्रयोगात्मक प्रदर्शनों की सूची का एक आम घटक बन गया है. शब्द "पश्चिमी धब्बा" का उपयोग PubMed का एक सरसरी खोज २२०००० प्रकाशित पांडुलिपियों से अधिक महत्वपूर्ण बात है वर्ष 2014 तक इस तकनीक का इस्तेमाल किया है पता चलता है कि पिछले दस साल के विकास के साथ मिलकर तकनीकी इमेजिंग अग्रिम देखा है संवेदनशीलता में सुधार और रैखिक का पता लगाने की भी अधिक से अधिक श्रेणियों मिले हैं, जिनमें से संवेदनशील फ्लोरोसेंट लेबल. परिणाम जीव पहले से कहीं अधिक संवेदनशीलता और सटीकता के साथ तुलनात्मक अभिव्यक्ति विश्लेषण बाहर ले जाने के लिए अनुमति देता है कि वेस्टर्न ब्लाट (QFWB) आधारित एक अब सही मायने में quantifiable प्रतिदीप्ति है. कई "अनुकूलित" पश्चिमी सोख्ताके तरीके मौजूद हैं और विभिन्न प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है. ये अक्सर कारण सूक्ष्म लेकिन undocumented प्रक्रियात्मक संशोधन की आवश्यकता को लागू करने के लिए मुश्किल साबित होते हैं. इस प्रोटोकॉल समस्या निवारण रणनीतियों के साथ पूरा एक स्थापित और मजबूत QFWB विधि के लिए एक व्यापक विवरण, प्रदान करता है.
पश्चिमी सोख्ता (पश्चिम बंगाल) मूल रूप से इस तरह के एक ऊतक homogenate 1 के रूप में, एक जटिल जैविक नमूने में ब्याज की एक प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए 1970 के दशक में विकसित एक विश्लेषणात्मक तकनीक है. आमतौर कारण कुंजी एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत करने के लिए, प्रोटीन immunoblot के रूप में भेजा, कार्यप्रणाली 5 अलग चरणों के होते हैं: उनके समविद्युतविभव बिंदु से प्रोटीन की 1) electrophoretic जुदाई; 2) एक nitrocellulose या polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली के लिए स्थानांतरण; 3) ब्याज की प्रोटीन के लिए विशिष्ट एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग लेबलिंग; प्राथमिक एंटीबॉडी के खिलाफ निर्देशित एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 4) ऊष्मायन; और 5) दृश्य.
दृश्य कार्यप्रणाली सुरक्षा और संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए समय के साथ विकसित किया गया है. पहले WBS में से कुछ तो अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल chemilluminescent (ईसीएल) के तरीकों तो वर्णमिति और प्रगति की जो रेडियो लेबल टैग का उपयोग किया गया. Radioactiviवर्णमिति और ईसीएल के तरीके ऐसे alkaline फॉस्फेट या streptavidin हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के रूप में 2 एक एंजाइम संवाददाता के साथ एक अप्रत्यक्ष लेबलिंग तकनीक का उपयोग जबकि Ty सीधे विशिष्ट प्रतिजन के लिए जांच पर चिह्नित किया गया. क्रोमाजेन या luminescent उत्पाद की लेबलिंग की तीव्रता मजबूत या कमजोर संकेत ताकत, नमूने में ब्याज की प्रोटीन की अधिक या कम उपस्थिति को इंगित करता है जिससे densitometry का उपयोग कर मापा जाता है. ईसीएल अधिक संवेदनशील है और इसलिए इष्ट कार्यप्रणाली 2 है लेकिन सभी 3 तरीकों शुरू में बाद में 3 की स्थापना की और अधिक परिष्कृत डिजिटल इमेजिंग तकनीक के साथ एक्स-रे फिल्म पर विकसित किए गए. पश्चिम बंगाल के डिजिटल इमेजिंग की उन्नति न केवल ब्याज की अपने प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए एक शोधकर्ता की अनुमति दी है, लेकिन अन्य नमूने के खिलाफ मुकाबले जब भी किसी चयनित प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर एक अनुमान अनुमति दी है और इसलिए के रूप में भेजा जा सकता है "अर्द्ध मात्रात्मक & #8221 ;. मापा प्रतिदीप्ति का स्तर सीधे एक नमूना भीतर मात्रा और एक भी प्रोटीन की अभिव्यक्ति से संबंधित है जिसके तहत हाल ही में, एक सही मायने में मात्रात्मक और अधिक संवेदनशील पश्चिमी सोख्ता तकनीक विकसित की गई है: मात्रात्मक (QFWB) सोख्ता पश्चिमी फ्लोरोसेंट.
ईसीएल लेबलिंग के साथ QFWB की तुलना, एक फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग एक रेखीय पता लगाने प्रोफाइल 4 उत्पन्न करता है. यह संकेत रैखिकता आम तौर पर सर्वत्र व्यक्त गृह व्यवस्था जीन 5,6 के साथ, यानी सीधे प्रोटीन अभिव्यक्ति से संबंधित 5 माइक्रोग्राम प्रति और संकेत संतृप्ति नीचे कम प्रोटीन भार, के साथ होता है, जहां ईसीएल तकनीकों के विपरीत है. यह असमानता सबसे अधिक संभावना संभावित संकेत संतृप्ति के एक उच्च संभावना है, जिसके परिणामस्वरूप एक biotinylated माध्यमिक के लिए बाध्य करने के लिए एक avidin ईसीएल सब्सट्रेट के लिए उपलब्ध बाध्यकारी साइटों की एक बड़ी संख्या के कारण होता है. इस रूप में onl के लिए भेजा जा रहा ईसीएल आधार immunoblotting के लिए मुख्य कारणों में से एक हैY "अर्द्ध मात्रात्मक" 7. अभिव्यक्ति के स्तर में सूक्ष्म अंतर को मापने और गलत माप का कारण बन सकता है जब संकेत के संतृप्ति बिंदु महत्व का है. हाल के वर्षों में बढ़ती संवेदनशीलता और सूक्ष्म अभिव्यक्ति भिन्नता की पहचान का ब्यौरा व्यापक प्रोटिओमिक तकनीक के आगमन के सत्यापन प्रयोगों 8,9 के लिए सही मायने में मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता पर बढ़ती निर्भरता में हुई है. संवेदनशील मजबूत और सही मायने में मात्रात्मक पद्धति के आवेदन इसलिए महत्वपूर्ण है.
कई "अनुकूलित" पश्चिमी सोख्ता के तरीके अक्सर कारण औपचारिक दस्तावेज प्रोटोकॉल में स्पष्ट नहीं हो सकता है कि सूक्ष्म पद्धति समायोजन स्थापित करने के लिए या दोहराने के लिए मुश्किल साबित हो जो स्वतंत्र प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया गया है. इस QFWB के लिए एक स्थापित और मजबूत प्रोटोकॉल है और साथ ही आम समस्याओं था समस्या निवारण के लिए मूल्यवान रणनीति प्रदान करता हैटी कार्यान्वयन के दौरान उत्पन्न हो सकती है.
इस प्रोटोकॉल मूल murine मस्तिष्क homogenates साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन बाद ऊतकों के नमूनों और प्रजातियों 4,9,10 की एक विस्तृत रेंज में प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया है. विशिष्ट समस्याओं के निवारण के लिए आवश्यक संभावित प्रोटोकॉल विविधताओं शामिल किए गए हैं.
कारण पर विचार और योजना किसी भी प्रयोग करने से पहले आवश्यक है और अंत में इस्तेमाल तकनीक की सफलता का निर्धारण कर सकते हैं. उपयुक्त एंटीबॉडी, स्थानांतरण और दृश्य तरीकों का उपयोग करने के लिए चयन करने के लिए कोशिश कर रहा है जब संभावित ब्लॉकों के ढेर सारे पेश कर सकते हैं पश्चिम बंगाल का उपयोग प्रोटीन का पता लगाने में प्रगति. सौभाग्य से, प्रोटीन उपस्थिति और नमूने के बीच तेजी से सूक्ष्म अभिव्यक्ति मतभेद निर्धारित करने के लिए नियमित तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता QFWB एक सावधान चेकलिस्ट और उचित नियंत्रण के उपायों का उपयोग. इस प्रोटोकॉल से बचने और / या इसके साथ जुड़े कई आम नुकसान की कुछ काबू पाने के लिए फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता के साथ-साथ कुछ समस्या निवारण रणनीतियों के लिए एक व्यापक मार्गदर्शन प्रदान करता है.
संवेदनशीलता को बनाए रखने और प्राप्त करने के लिए कार्यरत महत्वपूर्ण कदम सही मायने में व्यावहारिक और तुलनीय माप शामिल हैं: ऊतक के नमूने से 1) मजबूत प्रोटीन निकासी; 2) नमूना तैयार करने; 3) सही प्रोटीन loadinजी कुल प्रोटीन विश्लेषण द्वारा निर्धारित; मैं-ब्लाट का उपयोग प्रोटीन की 4) इष्टतम हस्तांतरण; एक अवरक्त इमेजर और संबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 0.1% Tween20 युक्त बफर अवरुद्ध में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के 5) तैयार करने, और 6) सही दृश्य और विश्लेषण.
इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए वास्तव में मात्रात्मक और अधिक परंपरागत ईसीएल पता लगाने की तकनीक 3,11 के साथ तुलना में अधिक संवेदनशीलता प्रदान करता है. यह पता लगाने की प्रणाली बहुपक्षीय बहु है, और इस तरह के रूप QFWB तक सीमित नहीं है. यह प्रणाली पूरे ऊतक वर्गों 12 के दृश्य और मात्रा का ठहराव की अनुमति कम बिजली पर immunohistological लेबलिंग की इमेजिंग में सक्षम है. इस मात्रात्मक आकलन के संदर्भ में पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी साथ पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस कब्जा rivaling दूर लाल इमेजिंग देख सकता था जो संकल्प के मामले में संभावित भविष्य के विकास का एक क्षेत्र है.
हालांकि, पी में सूक्ष्म परिवर्तन करने के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता के साथएक न्यूनतम और नियंत्रण उपायों के लिए रखा जाता है अभिव्यक्ति यह परिवर्तनशीलता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है rotein मजबूत प्रोटोकॉल के साथ कड़े हैं. यह नमूना लोड हो रहा वर्दी, पता लगाने के असली और संबंध में निर्माता के दिशा निर्देशों का परीक्षण स्थानांतरित करने के लिए है, तो यह निर्धारित करने के क्रम में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के अनुकूलन है कि आश्वासन प्रदान करने के लिए कुल प्रोटीन दाग जैल का उत्पादन द्वारा पीछा ऊतक के नमूने से कठोर प्रोटीन निष्कर्षण के साथ शुरू होता है टाइम्स कुशल प्रोटीन हस्तांतरण प्राप्त करने के लिए.
फिर भी, पश्चिम बंगाल के लिए शर्तें अनुकूलित कर रहे हैं, तब भी जब अभी भी समस्या को पूरी तरह से यहाँ का पता लगाया गया है नहीं हो सकता है कि वेस्टर्न चलाने के साथ वहाँ जुड़े हो सकते हैं. ये शामिल हैं, लेकिन प्रोटीन solubilization और निकासी बफर के विकल्प सहित कारकों तक सीमित नहीं हैं. कुछ बफ़र्स प्रोटीन एकाग्रता assays के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, और कुछ ऊतकों ऐसे स्वचालित macera के उपयोग के रूप में और अधिक मजबूत तकनीक की आवश्यकता होती है, solubilize के लिए विशेष रूप से कठिन हैंting के इस तरह के एक एमएसीएस dissociator के साथ एम ट्यूबों के रूप में कंटेनर सील. इसके अलावा, -80 डिग्री सेल्सियस पर निकाले और गैर निकाली गई सामग्री के भंडारण के लिए सरल नियंत्रण उपायों के तुरंत निकासी के बाद इष्टतम लेबलिंग प्राप्त करने और गरीब परिणाम हफ्ते बाद होने के बीच का अंतर हो सकता है.
आधुनिक QFWB तरीकों प्रोटीन अभिव्यक्ति में सूक्ष्म अंतर पर कब्जा करने के लिए और अधिक संवेदनशील साबित हो रहे हैं और इस तरह के ईसीएल के रूप में पुरानी तकनीक की तुलना में जब अधिक बहुमुखी एक साथ दोहरी लेबलिंग 3 अनुमति दे रहे हैं. यह पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल मजबूत और सही मात्रा का ठहराव और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आसानी से repeatable रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल विभिन्न ऊतकों के नमूनों और प्रजातियों 3 की एक किस्म में प्रोटीन का पता लगाने के लिए नियमित तौर पर इस्तेमाल किया जा संवेदनशील और काफी मजबूत है और इसलिए प्रयोग 1 प्रति उपभोज्य के उपयोग के साथ-साथ समय को कम करने के लिए एक ही QFWB भीतर कम और उच्च बहुतायत प्रोटीन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. 9,14 हालांकि सटीकता जिससे गलत डाटा अधिग्रहण से परहेज का पालन किया जाना चाहिए महत्वपूर्ण और उचित नियंत्रण के उपायों का समावेश है omic पढ़ाई – 1 इसके अलावा, इस तकनीक की वृद्धि की संवेदनशीलता में तेजी से लोकप्रिय के सत्यापन की अनुमति देता है.
The authors have nothing to disclose.
हम धन्यवाद करने के लिए वित्तीय सहायता के लिए निम्नलिखित चाहेंगे: बीबीएसआरसी संस्थान सामरिक कार्यक्रम अनुदान – सीएफ व TMW; बीबीएसआरसी पूर्व बायो डीटीपी वित्त पोषण – एलजी; एडिनबर्ग डार्विन ट्रस्ट – MLH. हम भी इस पांडुलिपि में TREM2 अनुकूलन शामिल करने की अनुमति के लिए डॉ बैरी McColl धन्यवाद देना चाहूंगा.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life technologies, UK | IB401001 | |
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
SeeBlue Pre-stained protein standard | Life technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
NuPAge LDS Sample buffer 4X | Life technologies, UK | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X) | Life technologies, UK | NP0002 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life technologies, UK | NP0322BOX | |
PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |