The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.
De late jaren 1970 zag de eerste publiekelijk gemeld gebruik van de western blot, een techniek voor de beoordeling van de aanwezigheid en relatieve rijkdom van specifieke eiwitten in complexe biologische monsters. Sindsdien heeft western blotting methode uitgegroeid tot een gemeenschappelijke component van de moleculaire biologen experimentele repertoire. Een vluchtige zoektocht van PubMed gebruik van de term "Western Blot" suggereert dat meer dan 220.000 gepubliceerde manuscripten gebruik van deze techniek hebben gemaakt in het jaar 2014. Belangrijk is, hebben de afgelopen tien jaar technische imaging vooruitgang in combinatie met de ontwikkeling gezien van fluorescente labels die verbeterde gevoeligheid en nog meer reeksen van lineaire detectie opgeleverd. Het resultaat is een nu echt Kwantificeerbaar Fluorescentie gebaseerd Western Blot (QFWB) waarmee biologen om vergelijkende expressie analyse uit te voeren met een grotere gevoeligheid en nauwkeurigheid dan ooit tevoren. Veel "geoptimaliseerd" western blottingmethoden bestaan en worden gebruikt in verschillende laboratoria. Deze blijken vaak moeilijk uit te voeren als gevolg van de eis van subtiele maar ongedocumenteerde procedurele wijzigingen. Dit protocol biedt een uitgebreide beschrijving van een gevestigde en robuuste QFWB methode, compleet met strategieën voor probleemoplossing.
Western blotting (WB) is een analytische techniek die oorspronkelijk ontwikkeld in de late jaren 1970 om de aanwezigheid of afwezigheid van een eiwit van interesse om een complex biologisch monster, zoals een weefsel homogenaat 1. Meestal aangeduid als eiwit immunoblot, Gezien de cruciale interactie van antilichaam-antigeen, de werkwijze bestaat uit 5 verschillende stappen: 1) de elektroforetische scheiding van eiwitten door hun iso-elektrisch punt; 2) de overdracht naar een nitrocellulose of polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan; 3) het labelen met een primair antilichaam dat specifiek is voor het eiwit van belang; 4) incubatie met een secundair antilichaam gericht tegen de primaire antilichaam; en 5) visualisatie.
Visualisatie methodiek is geëvolueerd met de tijd om de veiligheid en de gevoeligheid te verbeteren. Enkele van de eerste WBS werden uitgevoerd met radioactief gemerkt labels die vervolgens ontwikkeld tot colorimetrische en vervolgens de meer algemeen gebruikte chemilluminescent (ECL) methoden. Radioactivity werd direct gemerkt op probes voor specifieke antigenen dat kleur- en ECL methodologieën indirecte labeling techniek met een reporter enzym zoals alkalische fosfatase of streptavidine horseradish peroxidase (HRP) 2. De intensiteit van etikettering van de chromageen of luminescerende product wordt gemeten met densitometrie waarbij de signaalsterkte, sterk of zwak, geeft min of meer de aanwezigheid van het eiwit van interesse in het monster. ECL is het gevoeliger en dus bevoordeeld methodologie 2 maar alle 3 de methoden werden in eerste instantie ontwikkeld op x-ray film met meer geavanceerde digitale imaging technieken later vastgesteld 3. De vooruitgang van digitale beelden van WB niet alleen toegestaan onderzoeker om de aanwezigheid of afwezigheid van het eiwit van interesse te bepalen, maar ook toegestaan een gevolgtrekking om het niveau van expressie van een gekozen eiwit in vergelijking met andere monsters en kunnen daarom worden aangeduid als "semikwantitatieve & #8221 ;. Onlangs heeft een echt kwantitatieve en gevoeliger western blotting techniek ontwikkeld waarbij de mate van fluorescentie gemeten direct gerelateerd aan de hoeveelheid en expressie van een eiwit in een monster: kwantitatief fluorescent western blotting (QFWB).
Bij vergelijking QFWB met ECL etikettering, het gebruik van een fluorescerende secundair antilichaam genereert een lineair detectieprofiel 4. Dit in tegenstelling tot ECL technieken waar signaallineariteit gebeurt meestal met lage eiwit last van minder 5 ug en signaalverzadiging rechtstreeks verband houden met eiwitexpressie, dwz met alom tot expressie housekeeping genen 5,6. Dit verschil wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een groter aantal bindingsplaatsen beschikbaar tegen avidine ECL substraat te binden aan een gebiotinyleerd secundair, waardoor een grotere kans potentiële signaalverzadiging. Dit is een van de belangrijkste redenen voor ECL base immunoblotting wordt aangeduid als ONLy "semi-kwantitatieve" 7. Het verzadigingspunt van signaal van cruciaal belang bij het meten subtiele verschillen in expressieniveaus en kan leiden tot onnauwkeurige metingen. In de afgelopen jaren is de opkomst van grootschalige proteomics technieken detaillering steeds grotere gevoeligheid en identificatie van subtiele expressie verschillen heeft geleid tot een steeds grotere afhankelijkheid van werkelijk kwantitatieve western blotting voor validatie-experimenten 8,9. De toepassing van gevoelige, robuuste en echt kwantitatieve methodiek is daarom cruciaal.
Veel "geoptimaliseerd" western blotting methodieken zijn gebruikt door onafhankelijke laboratoria, die vaak blijken moeilijk op te zetten of te repliceren vanwege subtiele methodologische aanpassingen die niet duidelijk in formele gedocumenteerde protocollen kunnen zijn. Dit is een gevestigde en robuust protocol voor QFWB en bovendien geeft waardevolle strategieën voor het oplossen van gemeenschappelijke problemen that zich kunnen voordoen tijdens de uitvoering.
Dit protocol werd oorspronkelijk geoptimaliseerd voor murine hersenhomogenaten, maar is sindsdien effectief gebruikt in een breed scala van weefselmonsters en soorten 4,9,10. Potentiële protocol variaties nodig zijn voor specifieke kwesties oplossen van problemen zijn inbegrepen.
Inachtneming en planning essentieel voor experimenten en kan uiteindelijk het succes van de techniek bepaald. De vooruitgang in eiwitdetectie behulp WB kan een overvloed aan potentiële struikelblokken presenteren wanneer het proberen om te kiezen de juiste antilichamen, overdracht en visualisatie methoden te gebruiken. Gelukkig met een zorgvuldige checklist en geschikte voorzorgsmaatregelen QFWB routinematig worden gebruikt om de aanwezigheid eiwit en steeds subtiele verschillen tussen de expressie monsters te bepalen. Dit protocol biedt een uitgebreide gids voor fluorescerende kwantitatieve western blotting, evenals een paar strategieën voor probleemoplossing te voorkomen en / of te overwinnen enkele van de vele valkuilen die ermee verbonden zijn.
De kritische stappen gebruikt om de gevoeligheid te behouden en verkrijgen echt kwantificeerbare en vergelijkbare metingen omvatten: 1) uitgebreide eiwit extractie uit weefselmonsters; 2) voorbereiding van het monster; 3) nauwkeurige eiwit loading, bepaald door de totale hoeveelheid eiwit analyse; 4) een optimale overdracht van eiwitten met behulp van I-Blot; 5) de voorbereiding van de primaire en secundaire antilichamen in het blokkeren van buffer die 0,1% Tween 20, en 6) de juiste visualisatie en analyse met behulp van een infrarood imager en bijbehorende software.
Infrarood fluorescentiedetectie werkelijk kwantitatief en geeft grotere gevoeligheid tegenover traditionele ECL detectietechnieken 3,11. Dit detectiesysteem is met meerdere facetten, en als zodanig is niet beperkt tot QFWB. Dit systeem kan beeldvorming van immunohistochemisch etikettering gering vermogen zodat visualisatie en kwantificatie van hele weefselsecties 12. Dit is een gebied van potentiële toekomstige ontwikkeling in termen van resolutie, die veel rood imaging kon zien rivaliserende conventionele immunofluorescentie capturing met conventionele microscopen in termen van kwantitatieve beoordeling.
Echter, met een grotere gevoeligheid voor subtiele veranderingen in pProtein expressie is het cruciaal om de variabiliteit te garanderen wordt tot een minimum beperkt en beheersmaatregelen zijn strenger met robuuste protocollen. Dit begint met rigoureuze eiwit extractie uit het weefselmonster gevolgd door de productie van totaal eiwit gekleurde gels om zekerheid te verschaffen dat monster laden is uniform, optimalisatie van de primaire en secundaire antilichamen om te bepalen of de detectie is echt en het testen van de richtlijnen van de fabrikant met betrekking tot de over te dragen keer om een efficiënte eiwit overdracht te verkrijgen.
Maar zelfs wanneer de omstandigheden voor WB geoptimaliseerd, kan er nog problemen die gepaard gaan met westerns die niet volledig zijn hier onderzocht. Deze omvatten maar zijn niet beperkt tot factoren zoals eiwitten oplosbaar en keuze extractiebuffer. Sommige buffers kunnen verstoren eiwitconcentratie assays en sommige weefsels zijn bijzonder moeilijk te lossen, die robuuster technieken zoals het gebruik van geautomatiseerde Macerating verzegelde containers zoals M buizen samen met een Macs dissociator. Daarnaast kunnen eenvoudige controlemaatregelen voor opslag van geëxtraheerde en niet-geëxtraheerde materiaal bij -80 ° C het verschil tussen het verkrijgen optimale labeling onmiddellijk na extractie en hebben slechte resultaten weken later.
Moderne QFWB methoden zijn bewezen gevoeliger voor het vastleggen van subtiele verschillen in eiwit expressie te zijn en zijn veelzijdiger waardoor simultane dual labeling 3 in vergelijking met de oudere technieken zoals ECL. Het is essentieel dat western blotting protocollen zijn robuust en gemakkelijk herhaalbare voor nauwkeurige kwantificering en statistische analyse. Dit protocol is gevoelig en robuust genoeg om routinematig gebruikt voor de detectie van proteïnen in een verscheidenheid van verschillende weefselmonsters en soorten 3 en maakt kwantificering van hoge en lage abundantie proteïnen in dezelfde QFWB derhalve gebruik van verbruiksartikelen en tijd per experiment 1 verlagen. 1 Daarnaast is de verhoogde gevoeligheid van deze techniek maakt validatie van steeds populairder – sche studies 9,14 echter de nauwkeurigheid is van cruciaal belang en integratie van passende controlemaatregelen moeten worden nageleefd daardoor foutieve data-acquisitie vermijden.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag bedankt de volgende voor financiële steun: BBSRC Instituut Strategisch Programma Financiering – CF & TMW; BBSRC Oosten Bio DTP financiering – LG; De Darwin Trust van Edinburgh – MLH. We willen ook graag Dr Barry McColl bedanken voor toestemming om de TREM2 optimalisatie in dit manuscript bevatten.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life technologies, UK | IB401001 | |
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
SeeBlue Pre-stained protein standard | Life technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
NuPAge LDS Sample buffer 4X | Life technologies, UK | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X) | Life technologies, UK | NP0002 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life technologies, UK | NP0322BOX | |
PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |