The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.
O final da década de 1970 viu o primeiro relato do uso público do western blot, uma técnica para avaliar a presença e abundância relativa de proteínas específicas dentro de amostras biológicas complexas. Desde então, a metodologia blotting ocidental tornou-se um componente comum da biólogos moleculares repertório experimental. Uma pesquisa superficial da PubMed usando o termo "western blot" sugere que, em excesso de 220.000 manuscritos publicados têm feito uso desta técnica até o ano de 2014. É importante ressaltar que nos últimos dez anos temos visto avanços técnicos de imagem, juntamente com o desenvolvimento marcadores fluorescentes de sensíveis que melhoraram a sensibilidade e renderam ainda maiores gamas de detecção linear. O resultado é uma fluorescência agora verdadeiramente quantificáveis, com base Western Blot (QFWB) que permite que os biólogos para realizar análise de expressão comparativa com maior sensibilidade e precisão do que nunca. Muitos western blotting "otimizado"existem metodologias e são utilizados em diferentes laboratórios. Estes, muitas vezes revelar-se difícil de implementar devido à exigência de alterações processuais sutis, mas sem documentos. Este protocolo fornece uma descrição detalhada de um método QFWB estabelecida e robusta, com estratégias de resolução de problemas.
Transferência de Western (WB) é uma técnica analítica desenvolvida originalmente na década de 1970 para determinar a presença ou ausência de uma proteína de interesse numa amostra biológica complexa, tal como um homogeneizado de tecido 1. Normalmente referido como o de imunomarcação de proteínas, devido à interacção anticorpo-antigénio chave, a metodologia consiste em 5 etapas distintas: 1) a separação electroforética das proteínas por seu ponto isoeléctrico; 2) a transferência para uma membrana de nitrocelulose ou de difluoreto de polivinilideno (PVDF) da membrana; 3) marcação usando um anticorpo primário específico para a proteína de interesse; 4) a incubação com um anticorpo secundário dirigido contra o anticorpo primário; e 5) de visualização.
Metodologia Visualization evoluiu com o tempo para melhorar a segurança e sensibilidade. Alguns dos primeiros PEP foram realizadas utilizando rádio etiquetas marcadas que depois progrediram para colorimétrico e, em seguida, os mais amplamente utilizados quimioluminescência (ECL) métodos. Radioactivity foi marcado directamente para sondas para antigénios específicos enquanto que as metodologias colorimétricos e de ECL utilizar uma técnica de marcação indirecta com um repórter enzima, tal como fosfatase alcalina ou peroxidase de estreptavidina de rábano (HRP) 2. A intensidade de etiquetagem do produto cromagénio ou luminescente é medido por densitometria em que a intensidade do sinal, forte ou fraco, mais ou menos indica a presença da proteína de interesse na amostra. ECL é a metodologia mais sensível e, portanto, favorecido 2, mas todos os três métodos foram desenvolvidos inicialmente em filme de raios-x com técnicas de imagem digital mais sofisticadas posteriormente estabelecidas três. O avanço da imagem digital de WB não só é permitido um investigador para determinar a presença ou ausência da sua proteína de interesse, mas também permitiu uma inferência com o nível de expressão de uma proteína seleccionada, quando comparada com outras amostras e, portanto, pode ser referido como "semi-quantitativa & #8221 ;. Recentemente, uma tecnologia verdadeiramente quantitativo e mais sensível western blotting foi desenvolvida através do qual o nível de fluorescência medido está directamente relacionado com a quantidade e expressão de uma única proteína dentro de uma amostra: quantitativo fluorescente western blot (QFWB).
Quando se compara com QFWB rotulagem de ECL, a utilização de um anticorpo secundário fluorescente gera um perfil linear de detecção 4. Isto está em contraste com as técnicas de ECL em que a linearidade do sinal geralmente ocorre com baixas cargas de proteínas inferiores a 5 pg e saturação de sinal directamente relacionadas com a expressão da proteína, ou seja, com ubiquamente expressos genes housekeeping 5,6. Esta disparidade é provavelmente causada por um maior número de locais de ligação disponíveis para um substrato de ECL avidina para se ligar a um secundário biotinilado, resultando em uma maior probabilidade de saturação de sinal potencial. Esta é uma das principais razões para a base de ECL immunoblotting sendo referido como only "semi-quantitativa" 7. O ponto de saturação de sinal é de importância crítica ao medir diferenças sutis nos níveis de expressão e pode levar a medições imprecisas. Nos últimos anos, o advento das técnicas de proteómica generalizados detalhando cada vez maior sensibilidade e identificação das diferenças subtis de expressão resultou em uma dependência crescente em western blotting verdadeiramente quantitativo para experiências de validação 8,9. A aplicação da metodologia sensível, robusto e verdadeiramente quantitativa é, portanto, crucial.
Muitas metodologias de Western blotting "otimizados" têm sido utilizados por laboratórios independentes, que frequentemente provam difícil de configurar ou replicar devido a ajustes metodológicos sutis que podem não ser aparente em protocolos documentados formais. Este é um protocolo estabelecido e robusto para QFWB e, adicionalmente, fornece valiosas estratégias para solução de problemas comuns that podem surgir durante a implementação.
Este protocolo foi originalmente otimizado para uso com homogeneizados de cérebro murino, mas desde então tem sido utilizada de forma eficaz em uma ampla gama de amostras de tecidos e espécies 4,9,10. Variações de protocolo potenciais necessários para a solução de problemas específicos estão incluídos.
Consideração e planejamento Devido é essencial antes de qualquer experiência e pode, finalmente, determinar o sucesso da técnica utilizada. Os avanços na detecção de proteínas utilizando WB pode apresentar uma infinidade de potenciais obstáculos ao tentar escolher os anticorpos, métodos de transferência e visualização apropriado para uso. Felizmente, usando uma lista de verificação cuidadosa e medidas de controlo adequadas QFWB pode ser usado rotineiramente para determinar a presença de proteínas e diferenças de expressão cada vez mais sutis entre amostras. Este protocolo fornece um guia completo para transferência western quantitativa fluorescente, bem como algumas estratégias de resolução de problemas para evitar e / ou superar algumas das muitas armadilhas comuns associados.
As etapas críticas empregadas para manter a sensibilidade e obter medições verdadeiramente quantificáveis e comparáveis incluem: 1) a extração de proteínas a partir de amostras de tecido robusto; 2) a preparação da amostra; 3) loadin proteína precisasg determinada por análise das proteínas totais; 4) transferência óptima de proteínas, utilizando I-Blot; 5) a preparação de anticorpos primários e secundários em tampão contendo 0,1% de Tween 20 de bloqueio, e 6) correcta visualização e de análise utilizando um gerador de imagens de infravermelhos e software associado.
Detecção fluorescente no infravermelho é verdadeiramente quantitativa e proporciona maior sensibilidade em comparação com técnicas de detecção mais tradicionais ECL 3,11. Este sistema de detecção é multi facetada, e como tal não está limitado a QFWB. Este sistema é capaz de imagens de rotulagem imuno em baixa potência, permitindo a visualização e quantificação de seções inteiras de tecidos 12. Esta é uma área de desenvolvimento potencial futuro em termos de resolução, que podia ver imagens muito vermelho rivalizando com captura de imunofluorescência convencional com microscópios convencionais em termos de avaliação quantitativa.
No entanto, com maior sensibilidade a mudanças sutis na protein expressão é fundamental para garantir a variabilidade é mantido a uma série de medidas mínimas e controle são rigorosos com os protocolos robustos. Isto começa com a extracção de proteínas rigorosa a partir da amostra de tecido seguido de produção de proteína total géis corados para proporcionar uma garantia de que o carregamento da amostra é uniforme, a optimização de anticorpos primários e secundários, a fim de determinar se a detecção é real e testando as orientações do fabricante no que diz respeito à transferência vezes para se obter a proteína de transferência eficiente.
No entanto, mesmo quando são otimizadas condições para a WB, pode ainda problemas associados à execução westerns que podem não ter sido totalmente exploradas aqui. Estas incluem, mas não estão limitados a factores incluindo a solubilização e escolha de tampão de extracção de proteína. Alguns buffers possam interferir com os ensaios de concentração de proteína, e alguns tecidos são particularmente difíceis de solubilizar, exigindo técnicas mais robustos, tais como o uso de macera automatizadoting selados recipientes, como tubos M, juntamente com um Dissociator Macs. Além disso, medidas de controlo simples, para o armazenamento de material extraído e não extraído à temperatura de -80 ° C pode ser a diferença entre a obtenção de rotulagem óptimo imediatamente depois da extracção e tendo resultados pobres semanas mais tarde.
Métodos QFWB modernos são provou ser mais sensível para captar sutis diferenças na expressão de proteínas e são mais versáteis permitindo dupla marcação simultânea 3 quando comparado às técnicas mais antigas, como ECL. É vital que os protocolos de transferência Western são robustos e facilmente reproduzíveis para a quantificação exata e análise estatística. Este protocolo é sensível e robusto o suficiente para ser usado rotineiramente para a detecção de proteínas através de uma variedade de amostras de tecido diferentes espécies e 3 e permite a quantificação de proteínas de baixa e alta abundância no interior da mesma QFWB, por conseguinte, reduzindo o uso de consumíveis, bem como o tempo por um experimento. 1 Além disso, o aumento da sensibilidade desta técnica permite a validação de cada vez mais popular – estudos econó- 9,14 porém a precisão é crucial e inclusão de medidas de controlo adequadas devem ser respeitados evitando assim a aquisição de dados errôneos.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer a seguinte para o apoio financeiro: Instituto BBSRC Financiamento Programa Estratégico – CF & TMW; Financiamento BBSRC Leste Bio DTP – LG; O Darwin Trust of Edinburgh – MLH. Gostaríamos também de agradecer o Dr. Barry McColl permissão para incluir a otimização TREM2 neste manuscrito.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life technologies, UK | IB401001 | |
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
SeeBlue Pre-stained protein standard | Life technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
NuPAge LDS Sample buffer 4X | Life technologies, UK | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X) | Life technologies, UK | NP0002 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life technologies, UK | NP0322BOX | |
PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |