Summary

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Abstract

La réparation et la régénération du muscle squelettique nécessite l'action des cellules satellites, qui sont les cellules souches musculaires résident. Ceux-ci peuvent être isolés à partir d'échantillons de biopsie de muscle humain en utilisant une digestion enzymatique et leurs propriétés myogéniques étudiés en culture. Quantitativement, les deux principaux types de cellules adhérentes obtenues par digestion enzymatique sont les suivantes: (i) les cellules satellites (appelées cellules myogéniques ou de cellules précurseurs de muscle), identifié initialement comme CD56 + et par la suite en tant que CD56 + / desmine + cellules et (ii) muscle- fibroblastes dérivés, identifiés comme CD56 et TE-7 +. Fibroblastes prolifèrent très efficacement dans la culture et dans les populations de cellules mixtes ces cellules peuvent dépassement cellules myogéniques de dominer la culture. L'isolement et la purification de types de muscle humain de cellules différentes est donc une considération méthodologique importante lorsqu'il se agit d'enquêter sur le comportement inné ou l'autre type de cellules en culture. Ici, nous DESCRBIE un système de tri basé sur la digestion enzymatique douce de cellules en utilisant de la collagénase et de la dispase suivie magnétique tri cellulaire activé (MACS) qui donne à la fois une grande pureté (> 95% des cellules myogéniques) et avec un bon rendement (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 cellules / g de tissu après 7 jours in vitro) pour les expériences de culture. Cette approche repose sur l'incubation de la population de cellules dérivées du muscle mixte avec des microbilles magnétiques des billes conjuguées à un anticorps dirigé contre CD56 et puis en faisant passer les cellules si un champ magnétique. CD56 + liés à microbilles sont conservés par le champ tandis CD56 cellules passer sans entraves à travers la colonne. Les suspensions cellulaires de ne importe quelle étape du processus de tri peuvent être étalées et cultivées. Suite à une intervention donnée, la morphologie cellulaire et l'expression et la localisation des protéines, y compris des facteurs de transcription nucléaires peut être quantifiée en utilisant un marquage par immunofluorescence avec des anticorps spécifiques et une image pe traitement et logiciel d'analyse.

Introduction

La réparation et la régénération du muscle squelettique nécessite l'action des cellules satellites 1, les cellules souches myogéniques 2,3. In vivo ces cellules existent dans un état ​​réversible de repos située entre le sarcolemme et lame basale de chaque myofibre, mais se activent à proliférer, fusible et de différencier que le tissu musculaire est endommagé, réparer et régénérer 3. Les cellules satellites peuvent être isolés à partir d'échantillons de biopsie musculaire humaine jeunes et les personnes âgées en utilisant une digestion enzymatique 4 et leurs propriétés myogéniques peut ensuite être étudié en culture primaire 5. L'efficacité de ce processus d'isolement en ce qui concerne à la fois le rendement et la pureté de la population de cellules dépend des méthodes utilisées et peut varier d'un échantillon à. Les deux principaux types de cellules adhérentes obtenues à partir de la digestion enzymatique sont les cellules satellites (cellules myogéniques maintenant appelés ou des cellules précurseurs du muscle), identifiés initialement comme cellules CD56 + / desmine, et mufibroblastes SCLE dérivés, identifiés comme CD56 et TE7 + 5 cellules. Fibroblastes ont un taux de prolifération rapide et ne subissent pas un arrêt de croissance irréversible et différenciation terminale lors d'un contact cellule-cellule comme les cellules myogéniques; Ainsi, dans des populations mixtes, les fibroblastes peuvent dépassement cellules myogéniques à dominer la culture.

Fibroblastes ont souvent été considérée comme une irritation pour les biologistes musculaires, cependant, il ya maintenant un intérêt croissant dans les fibroblastes en cellules dignes d'étude à part entière, d'autant plus qu'ils ont été montré pour avoir un rôle de coopération avec des cellules myogéniques pendant la réparation musculaire 6 . L'isolement et la purification de types de muscle humain de cellules différentes est donc une considération méthodologique importante lorsqu'il se agit d'enquêter sur le comportement inné de deux types de cellules en culture. Fluorescence-activated tri cellulaire (FACS) est un procédé par lequel les cellules peuvent être triés pour une étude plus poussée et / ou comptées etanalyser. FACS a été montré pour enrichir de manière fiable cellules myogéniques humaines, mais le rendement des cellules pour la culture subséquente a jusqu'à présent pas été élevé 7. Compte tenu du potentiel de réplication limitée des cellules somatiques telles que les cellules satellite dérivés de cellules myogéniques et les très pauvres prolifération et la différenciation associés à la sénescence 4, des approches plus douces sont nécessaires. Simples cultures de fibres musculaires offrent une autre, moins agressive, des moyens d'obtenir des cellules satellites murins résident encore dans leur niche sublaminal et après leur activation dans la culture 8,9. Cependant, ce ne est souvent pas possible à partir de matériel de biopsie musculaire humaine (parce que les fibres peuvent rarement être obtenus à partir de tendon tendon) ce qui signifie que cette technique peut ne pas être accessible à de nombreux laboratoires de recherche intéressés à l'étude des cellules musculaires humaines dérivées. De plus, la technique de fibre simple ne fournit que le nombre de cellules très limitées.

Ici, nous décrivons un système de tri en fonction de la gendigestion enzymatique tle de cellules en utilisant de la collagénase et de la dispase suivie de deux cycles successifs de cellules activées magnétique de tri (de MACS) qui donne à la fois une grande pureté (> 95% des cellules myogéniques) et le rendement (~ 2,8 x 10 6 ± 8,87 x 10 5 cellules / g de tissu) pour des expériences dans la culture. CD56 est considéré comme le marqueur de surface or standard pour l'identification des cellules satellites humaines in situ et in vitro 10 et 11 fournit la surface de marqueur candidat idéal pour la fixation de talon. Dans cette approche anticorps CD56 conjugués à l'oxyde de fer et des billes superparamagnétiques contenant des polysaccharides sont liés aux cellules et passé à travers une colonne de séparation cellulaire magnétique à gradient élevé placé dans un champ magnétique puissant 12,13. Les colonnes de séparation sont remplis avec une matrice de laine d'acier ou de fer sphères ferromagnétiques qui servent à concentrer les lignes de champ magnétique vers leur surface générer des gradients de champ magnétique intense (~ de 4tesla) 14. Dans ces colonnes cellules même légèrement magnétiques sont attirés et adsorbées à leur surface 14. Non consolidé (CD56 -), les cellules passent à travers la colonne alors que CD56 + des cellules marquées avec des microbilles magnétiques sont retenues jusqu'à ce que le retrait du champ magnétique 12,15.

Les suspensions cellulaires de ne importe quelle étape du processus de tri peuvent être étalées à la densité désirée pour de nouvelles expérimentations. Suite à une intervention donnée les constituants cellulaires peuvent être identifiés en utilisant immunocytochimie, imagé en utilisant grand champ ou la microscopie confocale à fluorescence et analysé quantitativement en utilisant une approche d'analyse d'image qui permet une mesure objective rapide de toutes les cellules marquées dans une image donnée. Dans notre laboratoire, nous avons utilisé cette approche double tri immunomagnétique suivie par analyse d'image 16 pour démontrer que CD56 fibroblastes humains transdifférencient facilement dans les adipocytes, tandis que la cellule myogéniques d'origine par satellite sont très résistants à cette conversion adipogénique 5.

Protocol

NOTE: Pour les études réalisées dans notre laboratoire tous les sujets ont donné leur consentement écrit et éclairé à participer et à toutes les expériences ont été réalisées avec l'approbation du Comité d'éthique du National Health Service au Royaume-Uni (Comité éthique de la recherche de Londres; référence: 10 / H0718 / 10) et conformément aux la Loi sur les tissus humains et de la Déclaration d'Helsinki. 1. Préparation initiale Avant la biopsie musculaire …

Representative Results

Cellules fibroblastes et myogéniques purifiés peuvent être cultivées en milieu de différenciation adipocytaire pendant trois jours, suivie par du milieu de la nutrition adipogénique de ne importe où entre 7-30 jours pour évaluer leur potentiel de l'adipogenèse. Utilisation des populations cellulaires purifiées, Oil Red O en combinaison avec une coloration immuno-coloration pour les marqueurs de lignage adipogènes et myogéniques ont montré que seule la fraction de fibroblastes était capable de différen…

Discussion

Nous avons décrit un procédé de tri immunomagentic pour l'enrichissement sélectif de précurseurs musculaires humaines dérivées à partir de petits échantillons de matériau de biopsie musculaire. Cette technique a été inestimable dans notre laboratoire pour surmonter la perte de cultures dérivées du muscle de fibroblastes humains, mais également pour comprendre le comportement unique de populations distinctes de progéniteurs dérivées du muscle. Cellules myogéniques Une fois purifiés peuvent être ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.

Materials

Collagenase  D Roche  11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 micron cell strainer BD Biosciences 352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) Sigma, Dorset, UK C8919 
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) Sartorius 17573ACK Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human Miltenyi Biotech 130-050-601
40 μm Pre-separation filters Miltenyi Biotech 130-041-407
Large Cell Collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns  Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMacs Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 This separator fits the large cell column but not the LS column. 
MidiMACS Miltenyi Biotech  130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Must be filter sterilized before use
Oil Red O Sigma O0625
Triethyl phosphate Sigma 538728
Whatman Paper Sigma Z241121-1PAK No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. 
ProLong Gold Antifade Reagent Molecular Probes, Invitrogen P36930 This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision Carl Zeiss Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (purchased from Pugh Computers) ADPH16982* 

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Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. R. Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (95), e52049, doi:10.3791/52049 (2015).

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