İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu
Summary
The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.
Abstract
onarım ve iskelet kası rejenerasyon ikamet kas kök hücreleri uydu hücrelerinin eylem gerektirir. Bu kültürde okudu insan kas biyopsisi enzimatik sindirim kullanılarak örnekler ve onların Miyojenik özelliklerinden izole edilebilir. Kantitatif olarak, enzimatik sindiriminden elde edilen iki ana yapışık hücre tipleri şunlardır: (i) uydu CD56 + başlangıçta tanımlanan hücreler (bunlara miyojenik hücre ya da kas öncü hücreleri), daha sonra, CD56 + / + hücrelerinin desmin ve (ii) kaslarını ve TE-7 + – CD56 olarak tanımlanan türetilmiş fibroblastlar,. Fibroblastlar kültüründe çok verimli çoğalır ve karışık hücre popülasyonlarının bu hücrelerin kültürü hakim Miyojenik hücreleri istila edebilir. İnsan kas farklı hücre tiplerinin izolasyonu ve saflaştırılması, böylece kültür ya hücre tipi doğuştan davranışını araştırmak için çalışan önemli bir metodolojik bir husustur. Burada açıklanmayanher ikisi de, yüksek saflıkta (>% 95 miyojenik hücre) ve iyi bir verim (~ veren kolajenaz kullanarak hücrelerin yumuşak enzimatik sindirimiyle göre ayrılması ve manyetik aktive hücre sınıflandırma (MACS) takip dispaz bir sistem ibe 2.8 x 10 6 ± 8.87 kültür deneyleri için in vitro 7 gün sonra) x 10 5 hücre / g doku. Bu yaklaşım, CD56 karşı bir antikora konjuge manyetik mikro-boncuklar ile karışık kas kaynaklı hücre sicimli fragmanlar popülasyonu, ve daha sonra, bir manyetik alan da hücrelerin geçen dayanmaktadır. Mikro bağlı CD56 + hücreler CD56 ise alan tarafından korunur – hücreler sütununda boyunca engellenmeden geçen. Ayırma sürecinin herhangi bir aşamasında elde edilen hücre süspansiyonları kaplama ve kültüre edilebilir. Belirli bir müdahale, hücre morfolojisi, ifadesi ve nükleer transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere protein lokalizasyonu izlenerek özel antikorlar ve bir görüntü p immünofloresan etiketleme kullanılarak belirlenebilirrocessing ve analiz paketi.
Introduction
iskelet kası onarımı ve yenilenmesi uydu hücreleri 1, miyojenik kök hücreler 2,3. eylemini gerektirir in vivo bu hücreler, her myofibre ve sarcolemma ve bazal lamina arasında yer alan tersine çevrilebilir pasif durumda var, ama çoğalırlar aktif hale, sigorta ve kas dokusu gibi ayırt, hasar tamir ve 3 rejenere edilir. Uydu hücreleri enzimatik sindirim 4 kullanılarak genç ve yaşlı insan kas biyopsi örneklerinde ve onların Miyojenik özelliklerinden izole edilebilir sonradan primer kültür 5 incelenebilir. hücre popülasyonunun iki verim ve saflık açısından, bu izolasyon sürecinin verimliliği kullanılan yöntemler bağlıdır ve örnekten örneğe değişebilir. enzimatik sindiriminden elde edilen iki ana yapışık hücre tipi, CD56 + / desmin hücreleri ve mu başlangıçta tanımlanan uydu hücreler (şimdi olarak adlandırılan miyojenik hücre ya da kas ön-madde hücreleri) vardırSistemik lupus türetilmiş CD56 olarak tanımlanan fibroblastlar, – ve TE7 + hücreleri 5. Fibroblastlar hızlı çoğalma oranı ve kas hücreleri gibi, hücre-hücre temas üzerine geri dönüşü olmayan büyüme durmasını ve nihai farklılaşmasını uğramazlar; Böylece karışık toplumlarda, fibroblastlar kültürü hakim Miyojenik hücreleri istila edebilir.
Fibroblastlar genellikle Ancak, kendi başlarına incelenmeye değer hücreleri gibi fibroblastlar artan bir ilgi onlar kas tamir 6 sırasında myojenik hücreleri ile bir kooperatif bir role sahip olduğu gösterilmiştir özellikle de, şimdi var, kas biyologlar için bir tahriş olarak incelendi var . insan kas farklı hücre tiplerinin izolasyonu ve saflaştırılması, böylece kültür hem de hücre tipleri doğal davranışını incelemek için çalışan bir metodolojik bir husustur. Flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre tasnif (FACS) hücreleri, ayrıca çalışma için kriteri için kullanılabilecek bir yöntemdir ve / veya sayılarakanaliz edilmiştir. FACS güvenilir insan miyojenik hücrelerini zenginleştirmek için gösterilmiştir, ancak sonraki kültür için hücrelerin verimi bugüne kadar 7 yüksek olmamıştır. Böyle yaşlılığında 4 ile ilişkili uydu hücre kökenli myojenik hücreler ve çok kötü çoğalması ve farklılaşması gibi somatik hücre sınırlı çoğaltma potansiyeli göz önüne alındığında, daha yumuşak yaklaşımlar gereklidir. Tek kas lifi kültürleri başka, daha az agresif, onların sublaminal niş ve kültür 8,9 onların aktivasyon sonrasında hala ikamet kemirgen uydu hücreleri elde anlamına gelir sunuyoruz. Ancak, bu tekniğin insan kas-türetilmiş hücrelerin okuyan ilgilenen birçok araştırma laboratuarları için erişilebilir olmayabilir anlamına (lifler nadiren tendon tendon elde edilebilir çünkü) insan kas biyopsisi malzemeden genellikle mümkün değildir. Ayrıca, tek lif tekniği sadece çok sınırlı hücre sayıları sağlar.
Burada gen göre ayrılması bir sistemi tarifTLE enzimatik kolajenaz kullanarak hücrelerin sindirim ve manyetik aktif hücrenin iki ardışık mermi sıralama yüksek saflıkta (>% 95 miyojenik hücre) ve verimle (~ hem de verir (MACS) takip dispaz 2.8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 hücre / Kültürde gerçekleştirilen deneyler g doku). CD56 in situ 10 ve in vitro 11 insan uydu hücrelerin tanımlanması için altın standart yüzey işaretleyici olarak ve boncuk bağlanması için ideal bir yüzey işaretleyici aday sağlamaktadır. Bu yaklaşımda, CD56 antikorları, demir oksit ve polisakarit içeren süperparamanyetik boncuk güçlü bir manyetik alan 12,13 yerleştirilen bir yüksek değişim dereceli manyetik bir hücre ayırma kolonu boyunca hücrelere bağlanan ve geçirilir birleştirilir. ayırma kolonları güçlü manyetik alan eğimleri (~ 4tesla) üreten kendi yüzeyine doğru manyetik alan çizgileri odaklanmak hizmet ferromanyetik çelik yün veya demir küre bir matris ile doldurulur 14. Bu sütunlarda hatta biraz manyetik hücreler çekti ve bunların yüzeye 14 adsorbe. Ilişkisiz (CD56 -) manyetik mikro etiketli CD56 + hücreleri manyetik alanın 12,15 çıkarıldıktan kadar korunur ise hücreler sütununda geçer.
Ayırma sürecinin herhangi bir aşamasında elde edilen hücre süspansiyonları ayrıca deney için istenen yoğunluğa kaplama olabilir. Hücresel bileşenler imünosito kullanılarak tespit edilebilir, belirli bir girişim sonra, geniş bir alan veya konfokal floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi ve herhangi bir görüntünün tüm etiketli hücrelerin hızlı amacı ölçümü sağlayan bir görüntü analiz yaklaşımı kullanılarak kantitatif olarak analiz edildi. Miyojenik hücreye iken, insan fibroblastlar kolayca adipositlere transdifferentiate – Laboratuarımızda o CD56 göstermek için görüntü analizi 16 tarafından takip bu çifte immünomanyetik sıralama yaklaşımı kullanmışUydu kökenli lar bu adipojenik dönüşüm 5 derece dirençlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz kas biyopsi materyalinin küçük örneklerinden insan kas-türetilmiş öncülerinin seçici zenginleştirilmesi için bir immunomagentic sıralama prosedürü tarif var. Bu teknik, fibroblastlar insan kas-türetilmiş kültürlerin kaybı üstesinden gelmek için bizim laboratuvarda çok değerli, ama aynı zamanda kas kaynaklı atalarıdır farklı toplumlarda eşsiz davranışını anlamak için vardır. Bir kez saflaştırılmış miyojenik hücre proteini ve / veya gen ekspresyonunda değişiklikler incelenmi?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | Must be filter sterilized before use |
| Trypsin/EDTA | (Gibco) Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 micron cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Sigma, Dorset, UK | C8919 | |
| Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) | Sartorius | 17573ACK | Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane |
| CD56 human Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-050-401 | Be aware of the limited shelf life of microbeads |
| Anti- fibroblast Microbeads, human | Miltenyi Biotech | 130-050-601 | |
| 40 μm Pre-separation filters | Miltenyi Biotech | 130-041-407 | |
| Large Cell Collumns | Miltenyi Biotech | 130-042-202 | These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here. |
| LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MiniMacs Seperator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | This separator fits the large cell column but not the LS column. |
| MidiMACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| BSA | Sigma | Must be filter sterilized before use | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Triethyl phosphate | Sigma | 538728 | |
| Whatman Paper | Sigma | Z241121-1PAK | No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Molecular Probes, Invitrogen | P36930 | This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence. |
| AxioVision | Carl Zeiss | Contact Zeiss | |
| Adobe Photoshop CS5 Extended | Adobe (purchased from Pugh Computers) | ADPH16982* |
Referenzen
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
- Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
- Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
- Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
- Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
- Clarke, C., Davies, S., Brooks, S. A., Schumacher, U. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. 58, 17-23 (2001).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
- Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z., DiMario, J. X. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. 798, 21-52 (2012).
- Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
- Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
- Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
- Timpl, R., Kvonder Mark, . Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
- Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
- Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
- Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
- Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
- Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy – avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
- Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
- Fukada, S. -. i., et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
- Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).
