Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

1 Progettazione Sequenza e Sintesi Inizia MPRA con la progettazione e la sintesi di sequenze da dosare per attività di regolamentazione. Per la compatibilità con la serie vettore pMPRA, progettare ogni sequenza utilizzando la seguente configurazione: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- tag -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 ', dove var indica la sequenza da dosare e tag denota uno o più tag di identificazione. Le due regioni variabili (var e tag) sono separate da una coppia di KpnI (GGTACC) e XbaI (TCTAGA) siti di restrizione per facilitare la legatura direzionale di un frammento di gene reporter tra loro. Inoltre, due SFII (GGCCNNNNNGGCC) siti distinti saranno aggiunti mediante PCR per permettere la legatura direzionale nella spina dorsale pMPRA. Le regioni variabili non devono contenere ulteriori copie di qualsiasi di questi siti di restrizione. Se necessario, uno o più di questi enzimi di restrizione possono essere sostituiti, Fino a quando le sostituzioni 1) consentire il taglio efficiente vicino alle estremità di molecole di DNA, e 2) non tagliare altrove nella sequenza vettoriale. Vedi di discussione per ulteriori dettagli. Ottenere i primer richiesti elencati nella tabella 1 da un fornitore commerciale. MPRA_SfiI_F GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG MPRA_SfiI_R GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC TAGseq_P1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGseq_P2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [index] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG Tabella 1. sequenze di primer. [Indice] denota una sequenza indice 6-8 nt utilizzato per il sequenziamento multiplex. Ottenere almeno 8 primer TagSeq-P2 con indici differenti. Tuttodei primer deve essere purificata mediante HPLC o PAGE. Librerie oligonucleotide possono essere ottenuti da un fornitore o nucleo struttura commerciale, o generati utilizzando un programmabile basato microarray-oligonucleotide sintetizzatore come descritto dal produttore. Risospendere i prodotti OLS in 100 microlitri di buffer TE 0.1. Eseguire le librerie oligonucleotidiche su un TBE-Urea 10% denaturazione gel di poliacrilamide. Caricare circa 1 pmol per corsia e macchia con macchia fluorescente ssDNA-sensibile per valutare la qualità (Figura 2A). Se una band discreta corrispondente alle oligonucleotidi full-length può essere visualizzato (Figura 2A, corsie 1 e 2), asportare il corrispondente fetta gel di acrilammide ed eluire oligonucleotidi in 100 microlitri TE 0.1 notte a temperatura ambiente con agitazione. In caso contrario, procedere con l'OLS sospensione crudo. Amplifica e aggiungere le code SFII alla libreria oligonucleotide con emulsione PCR 9 </ sup>. Impostare 50 microlitri di miscele di reazione PCR come descritto nella Tabella 2. Poi si combinano con 300 ml di olio e miscela di tensioattivo dal DNA emulsione Micellula e kit di purificazione e vortex per 5 minuti a 4 ° C. Reagente 1x Volume (ml) Herculase II Fusion DNA polimerasi 0.5 Tampone di reazione 5x Herculase II 10 dNTP (10 mm ciascuno) 1.25 BSA (20 mg / ml) 1.25 MPRA_SfiI_F Primer (25 micron) 0.25 MPRA_SfiI_R Primer (25 micron) 0.25 Modello OLS (1-10 attomol) varia Acqua priva di nucleasi 50 ve_content "> Tabella 2 Emulsion PCR mix di reazione (fase acquosa). Utilizzare la concentrazione che dà la resa massima di prodotti di amplificazione senza la comparsa di artefatti (vedi sezione 1.12). Versare l'emulsione risultante in provette per PCR ed eseguire 20 cicli di PCR (2 min a 95 ° C, 20 x [20 sec a 95 ° C, 20 sec a 55 ° C, 30 sec a 72 ° C], 3 min a 95 ° C). Piscina e rompere ogni 350 ml di emulsione reazione di PCR con l'aggiunta di 1 ml di isobutanolo e brevemente vortex, e poi purificare il prodotto di amplificazione utilizzando una colonna di purificazione del DNA. Eseguire una aliquota su un gel di agarosio al 2% o 4% per verificare privo di artefatti di amplificazione (Figura 2B). Figura 2 Preparazione di librerie di sintesi di oligonucleotidi. A) </sTrong> Tre diverse biblioteche di sintesi di oligonucleotidi prime (OLS) eseguito su denaturazione del 10% TBE-urea gel di poliacrilammide. Bande corrispondenti a oligonucleotidi di lunghezza completa (*) possono essere visualizzati e asportati dalle librerie 1 e 2 Libreria 3 contiene contaminanti che interferiscono con la purificazione PAGE. Se questo è il caso, procedere direttamente al B amplificazione PCR.) Prodotti di aperto ed emulsione amplificazione PCR della stessa seduta biblioteca oligonucleotidi su un gel di agarosio. Amplificazione PCR di librerie di oligonucleotidi complessi crea frequentemente prodotti chimerici e altri artefatti che possono apparire come bande superiori e inferiori. Emulsione PCR può minimizzare questi manufatti. 2. Costruzione Biblioteca Preparare una spina dorsale plasmide linearizzato da digerire vettore pMPRA1 con Street Fighter II a 50 ° C per 2 ore, eseguito su un gel di agarosio 1%, asportare la fascia dorsale (in questo caso, 2,5 kb) e purificarlo utilizzando una colonna di spin di gel-purificazione. Digerirei prodotti di PCR emulsione dal punto 1.4 con Street Fighter II a 50 ° C per 2 ore e purificano utilizzando le colonne di purificazione del DNA. Per legare la libreria promotore tag nella spina dorsale vettore linearizzato, istituito reazioni contenenti 100 ng del prodotto della PCR digerito, 50 ng del vettore backbone linearizzato e DNA ligasi T4. Incubare per una notte a 16 ° C e poi il calore a 65 ° C per 20 minuti per inattivare la ligasi. Trasforma E. coli con la reazione legatura. Per preservare la complessità biblioteca, mirano a ottenere almeno 10x più cfu che ci sono distinte combinazioni promotore-tag nella libreria progettata. Quando il numero totale di tag è di circa 100.000, il cfu bersaglio può tipicamente essere ottenuto eseguendo 6-8 trasformazioni parallele per libreria. Per ogni trasformazione, unire 50 ml electrocompetent E. coli con 2 ml di mix legatura su ghiaccio. Trasformazione mediante elettroporazione, recuperare le cellule in 800 microlitri SOCsupporto con agitazione a 37 ° C per 1 ora, e poi unire celle dalle trasformazioni parallele. Per valutare l'efficienza di trasformazione, piastra diluizioni seriali da un alinquot di cellule recuperate su piastre di agar LB con 50-100 mg / ml carbenicillina e incubare una notte a 37 ° C. Stimare cfu totale come (cfu osservato) × (fattore di diluizione) × (V – v) / v, dove V è il volume totale delle cellule recuperati e v è il volume dell'aliquota prelevata per le diluizioni seriali. Al tempo stesso, utilizzare il resto delle cellule recuperate per inoculare 200 ml di LB integrato con 100 mg / ml carbenicillina. Crescere le cellule a 37 ° C per una notte in un incubatore shaker e poi isolare il DNA plasmidico secondo procedure standard. Digest un'aliquota della biblioteca isolata plasmide con SFII a 50 ° C per 2 ore e correre su un gel di agarosio 1% per confermare la presenza di inserti. Linearizzare la libreria plasmide da cUtting tra le varianti del promotore e tag utilizzando KpnI e XbaI. Per massimizzare l'efficienza di digestione, eseguire digestioni di serie: In primo luogo, digerire con KpnI a 37 ° C per 1 ora e purificare mediante biglie magnetiche. In secondo luogo, digerire con XbaI con l'aggiunta di 1 U Gambero fosfatasi alcalina a 37 ° C per 2 ore, il calore inattivare a 65 ° C per 5 minuti, e poi purificare con biglie magnetiche. Eseguire una aliquota su un gel di agarosio 1% per verificare completa linearizzazione. Se plasmide uncut è visibile, il frammento linearizzato va gel purificato. Per generare una libreria MPRA adatto per trasfezione in cellule di mammifero, legare un ORF con KpnI / XbaI estremità compatibili nella biblioteca intermedio linearizzato. Per preparare un luc2 ORF frammento compatibile da pMPRAdonor1, digerire il plasmide con KpnI e XbaI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio 1%. Accise il frammento ORF (1,7 kb in questo caso) e la purificazione mediante colonna di gel di depurazione centrifuga. Clonare il frammento ORF nella libreria intermedio linearizzato come descritto nei passaggi 2,3-2,8. Digest un'aliquota (corrispondente a 1-2 mg) della biblioteca MPRA con KpnI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio all'1%. Se la libreria digerito viene eseguito come una singola banda, passare alla sezione 3 Se si osservano bande addizionali (tipicamente corrispondente al riporto di costrutti intermedi), la libreria può essere ulteriormente purificato come segue: Digest 3-5 mg di biblioteca contaminato con KpnI a 37 ° C per 1 ora e correre su un gel di agarosio 0,8% per una notte a 4 ° C. Accise banda libreria corretta, purificare il DNA usando una colonna di spin purificazione gel ed eseguire auto-ligazione con alta concentrazione di T4 DNA ligasi a 37 ° C per 1 ora. Quindi ripetere la trasformazione e la biblioteca ultima estrazione del DNA come descritto al punto 2.8. 3 Transfection, Perturbazione, e RNA Isolation Per ogni trasfezione indipendente, la cultura il numero di cellule (come determinato dalla complessità biblioteca MPRA, vedi Discussione) in mezzo appropriato. Ad esempio, la cultura HEK293T / 17 cellule in DMEM supplementato con 10% FBS e L-glutammina / penicillina / streptomicina. Cellule di coltura per almeno due transfezioni indipendenti per ogni libreria e condizione sperimentale. Trasfezione le cellule in coltura con plasmidi MPRA. Il metodo e le condizioni di trasfezione devono essere ottimizzati per ogni tipo cellulare. Per ogni campione transfettate, mantenere una aliquota (50-100 ng) di DNA plasmide come controllo abbinato. Ad esempio, transfettare 0,5 x 10 7 HEK293T / 17 cellule cresciute al ~ 50% di confluenza in un piatto di cultura 10 centimetri con 10 mg DNA plasmidico in 1 ml di Opti-MEM ho ridotto siero Media utilizzando 30 microlitri Lipofectamine LTX e 10 ml più reagente. Rimuovere la miscela di trasfezione dopo 5 ore e permettere l'cellule di recuperare per 24-48 ore. Facoltativamente, eseguire qualsiasi perturbazione necessaria ad attivare sequenze regolatrici contestuali o segnale-dipendente nella libreria progettata. Raccogliere le cellule e isolare poli (A) + mRNA utilizzando colonne di cellulosa oligo (dT) standard o perline usando le istruzioni del loro produttore. Assicurarsi che la capacità massima di legame delle colonne o perline superare l'importo totale di mRNA previsto dalle cellule raccolte. Ad esempio, il rendimento atteso dalla sezione 3.3 è di circa 0,5-2,5 mg mRNA. 4. Tag-Seq Per eliminare i residui di vettore DNA dai lisati cellulari trasfettate, trattare ogni campione di mRNA 20 microlitri con 1 ml Turbo DNasi (2 U) e 2,3 microlitri di buffer 10x Turbo DNasi a 37 ° C per 1 ora, aggiungere 2,4 microlitri DNasi Turbo Inattivazione reagente a RT per 5 min con miscelazione, centrifugare a 10.000 g per 90 secondi, e poi trasferire la soluzione in una nuova provetta. Verificare purezza eseguendo PCR come descritto nel capitolo 4.6 da 60-100 ng di ciascun campione di mRNA, e quindi eseguendo i prodotti su un gel di agarosio. Se ampliconi specifici sono visibili (0,25 kb se si utilizza pMPRA1 con luc2), colonna purificare l'mRNA trattata e poi ripetere il trattamento DNasi. Per generare librerie di sequenziamento Tag-Seq, convertire giornalista mRNA in cDNA e aggiungere schede di sequenziamento mediante PCR. Impostare miscele di primer mRNA / RT come descritto nella Tabella 3. Incubare a 65 ° C per 5 minuti, poi disporli sul ghiaccio. In parallelo, impostare reazioni di sintesi di cDNA, come descritto nella Tabella 4. Reagente 1x Volume (ml) campione di mRNA (400-700 ng totale) 8 Oligo-0DT (50 micron) 1 dNTP (10 mm ciascuno) 1 ove_content "> Tabella 3 RNA / trascrizione inversa miscela di primer per la sintesi del DNA. Reagente 1x Volume (ml) 10x SuperScript III RT Buffer 2 MgCl 2 (25 mm) 4 DTT (0.1 M) 2 RNaseOut (40 U / ml) 1 SuperScript III (200 U / ml) 1 Tabella 4 cDNA mix di reazione di sintesi. Unire delicatamente mRNA / RT Primer mescola con miscele di sintesi cDNA. Incubare a 50 ° C per 50 min, 85 ° C per 5 minuti e poi posto su ghiaccio. Infine, incubare con 2 U di ribonucleasi H a 37 ° C per 20 min. Impostare reazioni PCR, come descritto nella Tabella 5 con 4-6 microlitricDNA miscela di reazione o 50 ng plasmide giornalista come modelli. Quindi eseguire amplificazione PCR (95 ° C per 2 min, 26 x [95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec], 72 ° C per 3 min). Reagente 1x Volume (ml) 2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix 25 TagSeq_P1 Primer (25 micron) 0.5 TagSeq_P2 Primer (25 micron) 0.5 Template (mRNA, cDNA mix o plasmide DNA) varia Acqua priva di nucleasi 50 Tabella 5 Tag-Seq Miscela di reazione PCR. Eseguire i prodotti di PCR attraverso un gel di agarosio al 2%, bande di accisa corrispondenti alle ampliconi libreria di tag-Seq (0,25 kb se si utilizzapMPRA1 con luc2) e purificare queste utilizzano colonne di spin purificazione gel. Piscina, denaturare e sequenziare i ampliconi Tag-Seq purificate direttamente con uno strumento di sequenziamento Illumina. Filtro di bassa qualità si legge eliminando tutto ciò che a) contenere uno o più posizione con una qualità Phred punteggio inferiore a 30 all'interno del tag in sequenza o b) non corrisponde esattamente un tag progettato. Contare il numero di volte che ogni tag rimanente appare in ogni libreria. Normalizzare i conteggi tag di TPM (tag per milione tag sequenziati) e quindi calcolare il rapporto tra i conteggi tag mRNA derivati ​​over-plasmide derivato tag conteggi per ogni coppia di librerie di sequenziamento. Se più tag diversi sono stati collegati per ogni variante di sequenza, utilizzare i loro rapporti mediani per l'analisi a valle.