Массивно-параллельных Репортер Анализы в культивируемых клетках млекопитающих

1 Последовательность дизайн и синтез Начните MPRA с дизайном и синтеза последовательностей, которые будут исследованы на регуляторной деятельности. Для совместимости с вектором серии pMPRA, проектировать каждую последовательность, используя следующий шаблон: 5'-ACTGGCCGCTTCACTG- вар -GGTACCTCTAGA- тег -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 ', где переменная обозначает последовательность, который надо анализировать и тег обозначает один или несколько идентифицирующих меток. Два вариабельные области (VAR и меток) разделены парой KpnI (GGTACC) и XbaI (TCTAGA) сайтов рестрикции для облегчения направленного лигирование гена репортер фрагмента между ними. Кроме того, два различных SfiI (GGCCNNNNNGGCC) сайты будут добавлены с помощью ПЦР, чтобы направленного перевязку в магистраль pMPRA. Вариабельные области не должны содержать дополнительные копии любого из этих сайтов рестрикции. Если необходимо, один или более из этих ферментов рестрикции, могут быть заменены, До тех пор, замен 1) позволяют эффективную резку близко к концам молекулы ДНК, и 2) не режут в другом месте в векторной последовательности. Смотреть Обсуждение для получения дополнительной информации. Получение необходимых праймеров, перечисленных в таблице 1, от коммерческих поставщиков. MPRA_SfiI_F GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG MPRA_SfiI_R GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC TAGseq_P1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT TAGseq_P2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [индекс] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG Таблица 1 Последовательности праймеров. [Индекс] обозначает последовательность индекса 6 до 8 нт, используемый для мультиплексированном секвенирования. Получить по крайней мере, 8 TagSeq-P2 праймеров с различными индексами. Всепраймеров должен быть очищен с помощью ВЭЖХ или PAGE. Олигонуклеотидные библиотеки могут быть получены из коммерческих поставщиков или основного объекта, или генерируется с использованием программируемого микрочипов на основе синтезатора олигонуклеотидов, как описано производителем. Ресуспендируют продукты МНК в 100 мкл ТЕ 0,1 буфера. Запуск олигонуклеотидных библиотек на 10% КЭ-мочевины денатурирующем полиакриламидном геле. Загрузите примерно 1 пмоль на полосу и пятна с оцДНК-чувствительного флуоресцентного красителя для оценки их качества (рисунок 2А). Если дискретная полоса, соответствующая полнометражных олигонуклеотидов могут быть визуализированы (2А, дорожки 1 и 2), вырезать соответствующее акриламида гель кусочек и элюирования олигонуклеотидов в 100 мкл ТЕ 0,1 в течение ночи при комнатной температуре при встряхивании. В противном случае перейдите использованием сырьевого МНК подвеску. Amplify и добавить SFII хвосты в библиотеку олигонуклеотидным использованием эмульсии ПЦР 9 </ вир>. Установка 50 мкл реакционной смеси ПЦР, как описано в таблице 2. Затем в сочетании с 300 мкл масла и поверхностно-активной смеси от Micellula ДНК эмульсии и набора для очистки и вихря в течение 5 мин при 4 ° С. Реагент 1x Объем (мкл) Herculase II Fusion ДНК-полимеразы 0.5 Буфер Реакция 5x Herculase II 10 дНТФ (10 мм каждый) 1.25 БСА (20 мг / мл) 1.25 Грунтовка MPRA_SfiI_F (25 мкм) 0.25 Грунтовка MPRA_SfiI_R (25 мкм) 0.25 МНК шаблон (1-10 attomol) меняется Нуклеазы без воды 50 ve_content "> Таблица 2 Эмульсия реакции ПЦР смесь (водная фаза). Используйте концентрацию, которая дает максимальный выход продуктов амплификации без появления артефактов (см раздел 1.12). Разлить полученную эмульсию в ПЦР пробирок и выполнять 20 циклов ПЦР (2 мин при 95 ° С, 20 х [20 сек при 95 ° С, 20 сек при 55 ° С, 30 сек при 72 ° С], 3 мин при 95 ° C). Бассейн и разорвать каждого эмульсионного ПЦР 350 мкл добавлением 1 мл изобутанола и кратко вортексе, затем очистить продукт амплификации с использованием колонки для очистки ДНК. Запуск аликвоту на 2% или 4% агарозном геле, чтобы проверить, без артефактов амплификации (фиг.2В). На рисунке 2 Получение библиотек синтеза олигонуклеотидов.) </sЧонг> Три различных библиотек сырье синтеза олигонуклеотида (МНК) работать на денатурирующих 10% КЭ-мочевины полиакриламидном геле. Полосы, соответствующие полной олигонуклеотидов длиной (*) могут быть визуализированы и вырезали из библиотек 1 и 2 Библиотека 3 содержит загрязняющие вещества, которые мешают очистке странице. Если это так, то перейти непосредственно к ПЦР-амплификации. Б) Продукты открытой и эмульсии ПЦР-амплификации и той же библиотеки олигонуклеотид перспективе на агарозном геле. ПЦР-амплификации сложных олигонуклеотидных библиотек часто создает химерные продукты и другие артефакты, которые могут появиться как высших и низших групп. Эмульсия ПЦР может минимизировать эти артефакты. 2 Библиотека Строительство Подготовьте линеаризованную плазмиды костяк расщеплением вектора pMPRA1 с SFII при 50 ° С в течение 2 часов, запускается на 1% агарозном геле, вырезать магистральную группу (в данном случае, 2,5 кб) и очистить его с помощью спиновой колонки гель-очистки. ДайджестЭмульсионные продукты ПЦР с шагом 1,4 с SFII при 50 ° С в течение 2 ч и очистить с помощью колонки для очистки ДНК. Лигировать библиотеку промотор-тегов в линеаризованный вектор, позвоночника, создана реакции, содержащие 100 нг продукта ПЦР переваренной, 50 нг линеаризованной векторного скелета и ДНК-лигазы Т4. Инкубируют в течение ночи при 16 ° С и затем нагревают при 65 ° С в течение 20 мин для инактивации лигазы. Трансформации E. палочка с реакции лигирования. Чтобы сохранить библиотеки сложности, направлены на получение по крайней мере еще в 10 раз КОЕ чем существуют различные комбинации промотор-тегов в проектируемой библиотеки. Когда общее количество меток примерно 100000, целевая КОЕ, как правило, может быть достигнуто путем выполнения 6-8 параллельных преобразований в библиотеке. Для каждого преобразования, объединить 50 мкл Электрокомпетентные Е. палочки клетки с 2 мкл лигирования смеси на льду. Преобразование с помощью электропорации, восстановление клеток в 800 мкл SOCсредний при встряхивании при 37 ° С в течение 1 часа, а затем объединить клетки из параллельных преобразований. Чтобы оценить эффективность преобразования, плиты серийных разведений от alinquot восстановленных клеток на чашках с агаром LB, с 50-100 мкг / мл карбенициллина и инкубируют в течение ночи при 37 ° C. Оценка суммарных КОЕ как (наблюдается КОЕ) × (разведение фактором) × (V – V) / V, где V является общий объем выделенных клеток и В составляет объем аликвоты принятым для серийных разведений. В то же время, использовать остаток от выделенных клеток для инокуляции 200 мл LB с добавлением 100 мкг / мл карбенициллина. Рост клеток при 37 ° С в течение ночи в шейкере инкубаторе, а затем изолировать плазмидной ДНК в соответствии со стандартными процедурами. Дайджест аликвоту изолированной плазмиды библиотеки с SFII при 50 ° С в течение 2 ч и обрабатывают на 1% агарозном геле, чтобы подтвердить присутствие вставки. Линеаризуем библиотеку плазмиды сUtting между вариантами промоутер и тегов с использованием KpnI и XbaI. Для максимальной эффективности пищеварения, выполнять последовательные варок: Во-первых, переваривают с KpnI при 37 ° С в течение 1 ч и очистить с помощью магнитных шариков. Во-вторых, переваривают с помощью XbaI с добавлением 1 U креветок щелочной фосфатазы при 37 ° С в течение 2 ч, тепловой инактивации при 65 ° С в течение 5 мин, а затем очистить с помощью магнитных шариков. Запустите аликвоту на 1% агарозном геле для проверки полного линеаризацию. Если режиссерский плазмиды видно, Линеаризованная фрагмент должен быть геле. Чтобы создать библиотеку MPRA подходящий для трансфекции в клетки млекопитающих, перевязывать в ORF с KpnI / XbaI совместимыми с RIHD концы в линеаризованной промежуточной библиотеки. Чтобы подготовить совместимый luc2 ORF фрагмент из pMPRAdonor1, переваривать этот плазмиду с помощью KpnI и XbaI при 37 ° С в течение 1 ч и обрабатывают на 1% агарозном геле. Акцизный фрагмент ORF (1,7 Кб в данном случае) и очищают с помощью колоночной хроматографии на отжима очистки. Клонировать фрагмент ORF в линеаризованной промежуточной библиотеки, как описано в шагах 2.3-2.8. Дайджест аликвоту (соответствующий 1-2 мкг) в библиотеке MPRA с KpnI при 37 ° С в течение 1 ч и обрабатывают на 1% агарозном геле. Если переваривается библиотеки проходит в виде одной полосы, перейти к разделу 3 Если дополнительные полосы наблюдаются (обычно, соответствующий переносу промежуточных конструкций), библиотека может быть дополнительно очищен следующим образом: Дайджест 3-5 мкг загрязненной библиотеки с помощью KpnI при 37 ° С в течение 1 ч и разгон ют на 0,8% агарозном геле в течение ночи при 4 ° С. Акцизный полосы соответствующего библиотеки, очищают ДНК с использованием колонки отжима очисткой на геле и выполнять самолигирование использованием высокой концентрации ДНК-лигазы Т4 при 37 ° С в течение 1 часа. Затем повторите выделения ДНК преобразование и конечное библиотеки, как описано в шаге 2.8. 3 Transfection, возмущений, и Выделение РНК Для каждой независимой трансфекции, культуры необходимого количества клеток (как определяется сложностью библиотеки MPRA см Обсуждение) в соответствующей среде. Например, культура HEK293T / 17 клеток в среде DMEM с добавлением 10% FBS и L-глютамин / пенициллин / стрептомицин. Культуры клеток для по крайней мере двух независимых трансфекций для каждой библиотеки и экспериментальных условиях. Трансфекции культивируемых клеток с MPRA плазмид. Способ и условия трансфекции должна быть оптимизирована для каждого типа клеток. Для каждого образца трансфицированных, сохраняют аликвоту (50-100 нг) плазмидной ДНК в качестве согласованной управления. Например, трансфекции 0,5 х 10 7 HEK293T / 17 клеток, выращенных в ~ 50% слияния в 10 см блюдо культуры с 10 мкг ДНК плазмиды в 1 мл Opti-MEM я уменьшил Serum Средний использованием 30 мкл Lipofectamine LTX и 10 мкл Plus Реагент. Извлеките трансфекции смесь в течение 5 часов и позволяютКлетки для восстановления в течение 24-48 часов. При желании, выполнять любые возмущения, необходимой для активации контекстно или сигнала зависит от регуляторных последовательностей в проектируемой библиотеки. Сбора клеток и изолировать поли (A) + мРНК с использованием стандартных олиго (дТ) колонки целлюлозы или шарики с помощью инструкции их производителя. Убедитесь, что максимальное связывающая способность колонн или шарики превышать общее количество мРНК ожидать от собранных клеток. Например, ожидается, выход из секции составляет примерно 3,3 0,5-2,5 мкг мРНК. 4 Tag-Seq Чтобы устранить унос векторной ДНК из клеточных лизатов трансфицированных, относиться к каждому 20 мкл образца мРНК с 1 мкл ДНКазы Турбо (2 U) и 2,3 мкл 10х буфера Turbo ДНКазы при 37 ° С в течение 1 часа, добавляют 2,4 мкл ДНКазы Turbo инактивации реагента при комнатной температуре в течение 5 мин при перемешивании центрифуге при 10000 г в течение 90 сек, а затем передать решение в свежую пробирку. Проверьте чистота при выполнении ПЦР, как описано в разделе 4.6 на 60-100 нг каждого образца мРНК, а затем работает продукты на агарозном геле. Если видны конкретные ампликоны (0,25 кб при использовании pMPRA1 с luc2), колонка очистить обработанную мРНК, а затем повторить лечение ДНКазы. Для создания тегов-Seq библиотеки секвенирования, конвертировать репортер мРНК в кДНК и добавить секвенирования адаптеры с помощью ПЦР. Установка праймеров смеси мРНК / RT, как описано в таблице 3. Инкубируйте при 65 ° С в течение 5 мин, затем поместить на льду. Параллельно создана реакции синтеза кДНК, как описано в таблице 4. Реагент 1x Объем (мкл) мРНК образец (400-700 общей нг) 8 Олиго-0DT (50 мкм) 1 дНТФ (10 мм каждый) 1 ove_content "> Таблица 3 РНК / Обратная транскрипция грунт смесь для синтеза кДНК. Реагент 1x Объем (мкл) 10x SuperScript III RT буфера 2 MgCl 2 (25 мМ) 4 ДТТ (0,1 М) 2 RNaseOut (40 ед / мкл) 1 SuperScript III (200 ед / мкл) 1 Таблица 4 кДНК реакции синтеза смесь. Аккуратно совместить мРНК / RT грунт смешивается с синтеза кДНК смесей. Инкубируют при 50 ° С в течение 50 мин, 85 ° С в течение 5 мин, а затем поместить на льду. Наконец, инкубировать с 2 U рибонуклеазы H при 37 ° С в течение 20 мин. Установка ПЦР-реакции, как описано в таблице 5 с 4-6 мклРеакционную смесь кДНК или 50 нг плазмидой репортера в качестве шаблонов. Затем выполните ПЦР-амплификации (95 ° С в течение 2 мин, 26 х [95 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек, 72 ° C в течение 30 сек], 72 ° C в течение 3 мин). Реагент 1x Объем (мкл) 2x PfuUltra II HotStart ПЦР Master Mix 25 Грунтовка TagSeq_P1 (25 мкм) 0.5 Грунтовка TagSeq_P2 (25 мкм) 0.5 Шаблон (мРНК, кДНК смесь или ДНК плазмиды) меняется Нуклеазы без воды 50 Таблица 5 Tag-Seq реакции ПЦР смесь. Запуск продуктов ПЦР через 2% агарозном геле, акцизные полос, соответствующих тегов-Seq библиотечных ампликонов (0,25 кб при использованииpMPRA1 с luc2) и очистить эти помощью спиновых столбцы очистки гель. Бассейн, денатурации и последовательности очищенные Tag-Seq ампликоны непосредственно с секвенирования Illumina инструмента. Фильтр низкого качества читает, удаляя все, что есть) содержат один или несколько позиций с качеством Phred набрали менее 30 в секвенированного тега или б) не точно соответствует проектную тег. Подсчитайте, сколько раз каждый из оставшихся тег появляется в каждой библиотеке. Нормализовать счетчики тегов для TPM (теги на миллион секвенированных тегов), а затем вычислить соотношение количества мРНК-полученных отсчетов тегов над плазмиды полученных тегов пунктам для каждой пары секвенирования библиотек. Если несколько разных теги были связаны с каждого варианта последовательности, использовать их медианные показатели для последующего анализа.