This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.
There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal’s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.
Overvåking neuronal aktivitet i et varsel dyr aktivt engasjert i et atferds oppgave er kritisk for å forstå funksjon og organisering av nervesystemet. Ekstracellulære opptak av den elektriske aktiviteten fra enkelt nevronale enheter har lenge vært et fast innslag verktøy av systemer nevrovitenskap og er fortsatt mye i bruk i dag. En rekke elektrodetyper og konfigurasjoner er tilgjengelige avhengig av de vitenskapelige og tekniske kravene til en bestemt eksperiment. Kronisk implanterte mikrodrivere eller elektrodegrupper er ofte brukt i fritt bevegelige dyr, inkludert fugler, gnagere og ikke-humane primater 1-4. Alternativt blir akutte gjennomføringer med metall eller glass microelectrodes via en ekstern micromanipulator ofte brukt til å ta opp fra bedøvede eller hode-behersket dyr. Glass mikropipette elektroder har den fordel at de kan brukes i juxtacellular eller "celle festet" konfigurasjon entydig å isolereaktivitet av enkeltnerveceller uten komplikasjoner av post-hoc pigg sortering 5. Disse elektroder videre muliggjøre registrering av anatomisk identifiserte celler eller steder, så de kan brukes til å injisere små forekomster av fargestoff eller nevroanatomi sporstoff, eller til å fylle de enkelte registrert cellen. Denne konfigurasjonen har blitt brukt i rotter, mus og fugler 6-10. Den beskrevne teknikken fokuserer på juxtacellular overvåking og ekstracellulære dye innskudd i varsling, head-behersket rotter. Merk at i motsetning enkelt celle juxtacellular fyller ikke disse dye depositum ikke gi informasjon om cellemorfologi eller aksonale anslag 11, men de gjør det mulig presis anatomisk lokalisering til ca 50 mikrometer og kritisk, har en betydelig høyere avkastning i varselet dyr. Informasjon om encellede juxtacellular fyller er likevel gitt som en alternativ strategi for anatomisk merking.
I korte trekk, denprotokollen består av tre hovedfaser. I den første fasen blir rotten akklimatisert til kroppsbeherskelse i en klut sokk (figur 1) over en periode på 6 dager. I den andre fasen, er et hodestøttene apparat (figur 2) og opptak kammer kirurgisk implantert slik at rotta kan opprettholdes i stereotaxic plan under flere påfølgende innspillinger (figur 3); denne prosedyren gjør at eksperimentator å målrette bestemte subkortikale regioner av hjernen for elektrofysiologisk undersøkelse basert på standard referanse koordinerer 12. Den tredje fasen innebærer å plassere rotte i en passende jigg for å gjennomføre de atferdsmessige og elektrofysiologiske eksperimenter (figur 4), bygging elektroden fra en kvarts kapillarrør (figur 5), noe som gjør juxtacellular nevronale opptak som entydig isolerer enkle enheter 6-9, og merking de anatomiske beliggpå fra opptaksstedet med Chicago himmelen blå fargestoff (figur 6 og 7). Opptakene er utført med samtidig atferds overvåking; Imidlertid vil de tekniske detaljer ved virkemåten være avhengig av de vitenskapelige målene for hvert forsøk og er således utenfor rammen av en enkelt protokoll. Etter fullføring av den eksperimentelle fremgangsmåte, som kan bli gjentatt på flere dager, er dyret avlives. Hjernen ble ekstrahert og behandlet i henhold til standard teknikker ved hjelp av nevroanatomi enten lyse felt eller fluorescens mikroskopi.
Byggingen av den eksperimentelle pilk
Beskrivelsen av de mekaniske deler som brukes til å bygge opp den eksperimentelle jiggen (figur 4) er utelatt fra protokollen, som det kan konstrueres på en rekke forskjellige måter. I denne demonstrasjonen standard opto-mekaniske deler og støtte klemmer blir brukt til å montere hodestøtten bar og kroppen beherskelse tube (se Materialer avsnitt). Lignende opto-mekaniske deler kan bruk…
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Canadian Institutes of Health Research (grant MT-5877), the National Institutes of Health (grants NS058668 and NS066664), and the US-Israeli Binational Foundation (grant 2003222) for funding these studies.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Ketaset (Ketamine HCl) | Fort Dodge | N/A | |
Anased (Xylazine solution) | Lloyd Laboratories | N/A | |
Betadyne (Povidone-Iodine) | CVS Pharmacy | 269281 | |
Loctite 495 | Grainger Industrial Supply | 4KL86 | 20-40 cp cyanoacrylate |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Grip cement powder | Dentsply Intl | 675571 | For the base of the recording chamber |
Grip cement liquid | Dentsply Intl | 675572 | For the base of the recording chamber |
Silicone Gel | Dow Corning | Mar-80 | |
Jet denture repair acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
Ortho-Jet Fast curing orthodontic acrylic resin liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | N/A | For securing the head restraint apparatus to the cranium |
Chicago sky blue | Sigma | C8679 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For perfusion and tissue fixation |
Phosphate-buffered saline | Sigma | P3813 | For perfusion and tissue fixation |
Cytochrome C | Sigma | C2506 | For cytochrome-oxidase staining (Figure 7) |
Diaminobenzidine | Sigma | D5905 | For cytochrome-oxidase staining (Figure 7) |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Rat sock | Sew Elegant (San Diego, CA) | N/A | Custom made, Figures 1, 4 |
PVC tube 2 ½” | U.S. Plastic Co. | 34108 | Figure 4 |
Subminiature D pins & sockets | TE Connectivity | 205089-1 | Figure 3 |
Stainless steel music wire 0.010” diameter | Precision Brand Products, Inc. | 21010 | Figure 3 |
Stereotaxic holding frame | Kopf Instruments | Model 900 | Figure 3 |
Stereotaxic ear bars | Kopf Instruments | Model 957 | Figure 3 |
Stereotaxic manipulator | Kopf Instruments | Model 960 | Figure 3 |
½ mm drill burr | Henry Schein | 100-3995 | |
Quiet-Air dental drill | Midwest Dental | 393-1600 | |
Stainless steel 0-80 1/8” screw | Fastener superstore | 247438 | Figure 3 |
0.2mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-407-8A | Figure 3 |
Custom head-holding bar | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figures 2, 3, 4 |
Custom head-holding plate | UCSD SIO Machine Shop | N/A | Custom made, Figure 2, 3, 4 |
Right angle post-clamp | Newport | MCA-1 | Figure 3,4; standard opto-mechanical parts for the experimental jig (Figure 4) are also from Newport Corp. |
8-32 3/4” screw | Fastener Superstore | 240181 | For head-restraint, Figure 3 |
4-40 ¼” screw | Fastener Superstore | 239958 | For head restraint, Figures 3, 4 |
Quartz capillary tubing | Sutter Instruments | QF-100-60-10 | Figure 5 |
Carbon dioxide laser puller | Sutter instruments | P-2000 | |
Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
Microelectrode amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | Alternate part: Molecular Devices Axoclamp 900A |
Microelectrode amplifier head stage | Molecular Devices | CV-7B | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
Isolated pulse stimulator | A-M Systems | Model 2100 | Alternate part: HS-9Ax10 with Molecular Devices Axoclamp 900A |
Audio monitor | Radio Shack | 32-2040 | |
Pipette holder | Warner Instruments | #MEW-F10T | Alternate parts: see Discussion |
Figure 6A | |||
Electrode lead wire | Cooner wire | NEF34-1646 | (optional), Figure 6D |
Relay for amplifier head-stage | COTO Technology | #2342-05-000 | (optional) Used with a custom-made printed circuit board (UCSD Physics Electronics Shop), Figure 6A-C |
Digital video camera | Basler | A602fm | (optional) For behavioral monitoring, Figure 7 |