視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

パルミチン酸（PA）などの飽和脂肪酸が豊富な食事は、心血管疾患および糖尿病^1、2を含む、肥満および他の併存疾患に関連している。高脂肪食はまた、酸化ストレス、アポトーシス、および視床下部の神経変性、食欲及びエネルギー消費^3-7の重要な調節因子を増加させることが示されている。高脂肪食の露出が視床下部調節不全を誘導するメカニズムを理解することは、肥満のための薬理学的治療の開発のためのが重要である。しかし、食事の脂肪が神経機能に影響を与えるそれを通して細胞メカニズムは不明である。このようなPAとして脂肪が視床下部アポトーシス経路の発症を誘発するかもしれない方法をよりよく理解するには、この目的に向けて必要な最初のステップです。この記事の目的は、Hの研究に使用するために開発されたPA暴露に対する神経細胞応答のin vitro試験のためのマルチプレックスアッセイを、説明することであるypothalamic神経変性。我々は、PA ⁸との酸化的攻撃後（A12と称する）に分化する不死化成体マウスの視床下部細胞株における細胞の総数あたりの3月7日の活動カスパーゼを測定するためのin vitroでの 96ウェルフォーマットの多重検定の詳細な説明を提供する。

簡潔には、細胞生存率をレサズリン基づくアッセイを介してPAチャレンジを下記判定される。レサズリンは、代謝的に活性な細胞中の酵素の減少、ミトコンドリア⁹を介して起こると考えプロセスを受ける細胞透過性化合物である。生存細胞は、連続的に生細胞数に比例する蛍光シグナルを生成するレゾルフィンレサズリン変換する。カスパーゼ3/7活性を、次いで、DEVD-lumogenicベースのアッセイを用いて分析する。 DEVDはカスパーゼ3により切断されるアミノ酸配列（のAspのGlu-Aspで、ヴァル）である。この配列は、細胞内カスパーゼ3/7の活性化およびその後の切断の際に、lumogenic物質に結合されるとDEVD基板から、発光生成物が放出される。この反応は、カスパーゼ活性を、したがってアポトーシスの誘導に比例する。死んだ細胞は、カスパーゼを生産することができないように、カスパーゼ3/7活性を、自然の過渡的である。したがって、解析は細胞ストレッサーの効果によって、4時間後にチャレンジに30分の間に完了する必要があります。細胞生存率は、カスパーゼ3/7活性に反比例し、細胞死のメカニズムを決定するために用いることができる。例えば、この方法は、以前にオレキシンが、この処置によって影響メカニズムは酸化的損傷¹⁰に対する保護において重要であることを示唆し、過酸化水素でチャレンジ視床下部の細胞においてアポトーシスを減少させるペプチドホルモンとその前処理を示すために使用されている。それは、それらがアッセイ試薬を減少させるためにミトコンドリア活性に依存して、これらのアッセイは、細胞株および組織に依存する注意することが重要である。このプロトコルは、成体マウスの視床下部（A12）細胞用に最適化されています。しかし、記載された方法は、類似の研究の範囲内に収まるように変更することができる。

単一培養ウェルからの多重化アッセイは、いくつかの理由で個別のアッセイを行う従来の方法に勝る利点を提供する。時間、細胞試料、および培養試薬を保存することに加えて、多重化アッセイは、細胞生存と死の知識を提供内部対照を提供し、反復的な実験^11,12の必要性を排除することができる。

代替法は、96ウェルフォーマットを使用している場合は特に、信頼性の高いアッセイであるウェスタンブロットまたはELISAを、依拠するが、費用と時間がかかる（1〜2日）であるている。それは、多重化アッセイのために細胞を培養するのに要する時間を除くと、合計時間は3時間未満である。このプロトコルはA12細胞との使用に最適化されたが、細胞の完全性に影響を及ぼし得る要因を念頭に保ちながら、それは他のモデルで使用するために変更されてもよい。抑止するこのプロトコルは、一連の実験のために働くかどうマイニングは、サンプルや実験条件の数にして計画されたダウンストリーム実験に依存します。