使用胱天蛋白酶复分析，以确定细胞凋亡的下丘脑细胞模型

饮食富含饱和脂肪酸如棕榈酸（PA）的已与肥胖和其他并发症，包括心血管疾病和糖尿病^1,2。高脂肪饮食也已显示出增加的氧化应激，细胞凋亡，和在下丘脑的神经元变性，食欲和能量消耗^3-7中的重要调节器。了解通过高脂饮食诱导的曝光下丘脑功能失调的机制是对肥胖的药物治疗发展重要的。然而，通过这些食物中的脂肪会影响神经元功能的细胞机制仍不清楚。更好地理解如何脂肪如PA可能会引发发病丘脑凋亡途径是迈向这一目标的必要的第一步。本文的目的是描述一个多重检测用于体外测试与PA曝光神经元的反应，对于在H的研究开发利用ypothalamic神经退行性病变。我们提供了一种体外的96孔格式的多重检测，用于测量胱天蛋白酶每个细胞中分化的永生化的成体小鼠的下丘脑细胞与PA的⁸氧化攻击后线（称为A12）总数3/7活性的详细说明。

简单地说，细胞存活率确定通过基于刃天青分析如下PA的挑战。刃天青是经历酶减少，代谢活跃的细胞的细胞渗透性化合物想到一个过程，通过线粒体⁹出现。活细胞连续转换刃天青到试卤灵，产生的荧光信号正比于活细胞的数量。胱天蛋白酶3/7活性，随后分析使用DEVD-基于lumogenic测定。 DEVD是由胱天蛋白酶-3切割的氨基酸序列（ASP-GLU-VAL-ASP）。当该序列被耦合到lumogenic物质，在激活时细胞内的胱天蛋白酶3/7的和随后的裂解DEVD基板，发光产物被释放。该反应正比于胱天蛋白酶活性，从而诱导细胞凋亡。由于死细胞不能产生，即caspase-3/7活性本质上是短暂的;因此分析应该在30分钟至4小时后挑战之间完成，这取决于细胞应激的效果。细胞活力是成反比的胱天蛋白酶3/7活性，并且可以用于确定细胞死亡的机制。例如，该方法以前已经用来表明预处理与肽激素食欲减少细胞凋亡的挑战与过氧化氢 ​​的下丘脑细胞，这表明影响此治疗机制在防止氧化损伤¹⁰重要。要注意这些试验是细胞系和组织依赖性的，因为它们依赖于线粒体活性降低测定试剂是非常重要的。该协议已被优化，成年小鼠的下丘脑（A12）细胞;然而，所描述的方法可以被改变，以适应类似研究的范围之内。

从一个单一的复用培养测定以及提供了对个体进行测定几个原因的传统方法的优点。除了 ​​节省时间，细胞样本，并培养试剂，复分析还可以提供细胞存活和死亡的知识，提供内部控制，并省去了重复实验^{，11，12。}

可供选择的方法都依赖于蛋白质印迹或ELISA中，这是可靠的测定法，但价格昂贵和费时的（1-2天），使用96孔形式时尤其如此。不含花费来培养细胞为复测定的时间，总时间不超过3小时。虽然该协议已被优化，与A12单元格的使用，它可以同时考虑的因素可能影响细胞的完整性来改变用于其他车型。阻止如果该协议将工作的一系列实验采矿取决于样本或实验条件的数量以及规划下游实验。