Moleculaire signalering via zowel oestrogeen en microRNA's zijn cruciaal in de ontwikkeling en de groei van borstkanker. Oestrogeen activeert de oestrogeenreceptoren die transcriptiefactoren. Veel transcriptiefactoren kan de expressie van microRNA's te reguleren, en oestrogeen-gereguleerde microRNA kunnen worden geprofileerd met behulp van verschillende grootschalige technieken.
Oestrogeen speelt een belangrijke rol bij ontwikkeling van de borstklier en borstkanker progressie. Het bemiddelt zijn functie door te binden aan en activeren van de oestrogeenreceptoren (ERS), ERa en ERP. ERa wordt vaak opwaarts gereguleerd bij borstkanker en drijft de proliferatie van borstkankercellen. De ERs fungeren als transcriptiefactoren en genexpressie reguleren. Overwegende dat de regeling van proteïne-coderende genen ERa's goed ingeburgerd is, de regulering van niet-coderende microRNA (miRNA) is minder bestudeerd. miRNAs spelen een belangrijke rol in de post-transcriptionele regulatie van genen, remmen hun vertaling of vernederende hun mRNA. miRNAs kan functioneren als oncogenen of tumorontstoringsapparaten en belooft ook biomarkers. Onder de miRNA assays beschikbaar microarray en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) zijn uitgebreid gebruikt voor miRNA niveaus detecteren en kwantificeren. Om miRNAs gereguleerd door oestrogeen signalering bij borstkanker, th identificereneir expressie in ERa-positieve borstkanker cellijnen werden vergeleken voor en na de oestrogeen-activering met behulp van zowel de μParaflo-microfluïdische microarrays en Dual gelabelde probes-lage dichtheid arrays. De resultaten zijn gevalideerd met specifieke qPCR assays, het toepassen van zowel Cyanine dye-based en Dual gelabelde probes-gebaseerde chemie. Bovendien werd een time-point test gebruikt om regelgeving in de tijd te identificeren. Eigenschappen miRNA assay benadering in deze studie is dat het mogelijk maakt een snelle screening van rijpe miRNA voorschriften tal monsters, zelfs met beperkte monsterhoeveelheden. De lay-out, met inbegrip van de specifieke voorwaarden voor celcultuur en oestrogeen behandeling, biologische en technische herhalingen, en grootschalige screening gevolgd door een grondige bevestigingen gebruik van afzonderlijke technieken, zorgt voor een robuuste detectie van miRNA regelgeving, en elimineert valse positieven en andere artefacten. Echter, gemuteerd of onbekende miRNAs, of regelgeving op de primaire en voorloper transcript leveIk zal niet worden gedetecteerd. De hier gepresenteerde methode is een grondig onderzoek van oestrogeen-gemedieerde miRNA regelgeving.
Oestrogeen is een hormoon dat belangrijk tijdens ontwikkeling van de borstklier. Oestrogeen speelt ook een belangrijke rol in de ontwikkeling, het onderhoud, risico's en behandeling van borstkanker 1. Oestrogeen oefent zijn functie door te binden aan ERs, die transcriptiefactoren zijn en reguleren specifieke doelgroepen genen. Van de twee receptor varianten ERa essentieel is voor oestrogeen-afhankelijke proliferatie van borstkankercellen. De meeste borstkankers zijn ERa-positief en is afhankelijk van oestrogeen voor groei. Dit heeft oestrogeen signalering gemaakt en ERa een doelwit voor de behandeling van hormoon-receptor positieve borstkanker. Inzicht in het onderliggende mechanisme van ERa is belangrijk om behandelingsresultaten te verbeteren, te overwinnen weerstand tegen de behandeling, en te begrijpen hoe borstkanker ontwikkelt.
miRNAs spelen cruciale rol in cel functies als gevolg van hun grote invloed in post-transcriptionele genregulatie. miRNAs zijn 19-24 nucleotiden kort enkelstrengs, Niet-coderende RNA's die eerst worden getranscribeerd door RNA polymerase II in primaire miRNA transcripten (pri-miRNA). Ze worden verwerkt in de kern door Drosha in korte haarspeld precursor-miRNAs (pre-miRNA) en vervolgens verwerkt door Dicer en gescheiden in enkele strengen te rijpen miRNAs in het cytoplasma te vormen. De enkelstrengs mature miRNAs worden overgebracht naar Argonaute eiwitten RISC complex. Vervolgens kan de miRNAs hybridiseren met het 3'-ongetranslateerde gebieden (3'-UTR) van een doel-mRNA, wat leidt tot post-transcriptionele regulatie blokkeert translatie of verslechtering van de doel-mRNA 2.
Vanwege de belangrijke rol die zowel oestrogeen als miRNAs bij tumorprogressie, identificeren miRNAs geassocieerd met normale of verstoord oestrogeen signalering is belangrijk om ons inzicht in de ontwikkeling verhogen en behandeling van borstkanker. Hoewel er een goed begrip van hoe ERa regelt eiwit-coderende genen, de uitbreidingen gegevens van niet-coderende RNA regelgeving moet nog grondig worden onderzocht. Eerste studies gericht op ERa regulering van miRNA in borstkanker cellijnen helderen hebben tegenstrijdige resultaten opgeleverd, zelfs wanneer dezelfde cellijn is geanalyseerd 3-6. Dit kan een gevolg van verschillende behandelingen, biologische variaties, het gebruik van verschillende technieken, en het feit dat de kleine omvang van miRNAs ze moeilijk te analyseren. Hier wordt een protocol dat regelt voor variaties en methode artefacten beschreven.
Om te bepalen welke miRNAs worden gereguleerd door oestrogeen, profilering van een goed gedefinieerde borstkanker model van ERa activiteit is een eerste stap. Verscheidene cellijnen werden gegenereerd uit humane ERa-positieve borstkanker tumoren, die afhankelijk oestrogeen vergelijkbaar met de meeste klinische borstkanker zijn. De moleculaire eigenschappen van twee van deze cellijnen, T47D en MCF7 en het uiten van ERa en de downstream-doel,het hormoon progesteron receptor (PR), een gebrek aan expressie van membraan receptor HER2, samen met expressie van oestrogeen-responsieve en-luminale epitheliale differentiatie genen, ze geschikt als modellen voor de luminale subtype van borsttumoren 7-10. 17β-oestradiol (E2) is de overheersende vorm van oestrogeen en de concentraties en tijdstippen voor optimale transcriptionele activering van ERa zijn gekarakteriseerd in meerdere studies. In dit protocol 10 nM E2 behandeling van 24 uur gebruikt waarbij T47D en MCF7 als modellen voor ERa activiteit in borstkankercellen 1. Bovendien tijdsafhankelijk miRNA bepalingen kunnen worden bepaald in een tijdsinterval van bijvoorbeeld 1-72 uur geanalyseerd.
Ten tweede, het analyseren van miRNA heeft aparte uitdagingen, mede door hun korte maten. miRNA's zijn niet goed behouden in de totale RNA-bereiding bij reguliere Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA neerslag worden uitgevoerd, of wanneer stAndard kolom zuiveringen worden gebruikt. Speciale voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen handhaven of te verrijken voor de kleinere fractie van RNA. Door verhoging van isopropanol, verlagen van de temperatuur vóór centrifugatie (-80 ° C), en weglaten van de wassen in 70% ethanol, kan het behoud van miRNAs worden versterkt tijdens neerslag. Of kunnen specifieke kolommen en buffers voor een hoogwaardige en robuuste bereiding van miRNA bevattende totaal RNA worden gebruikt. Ook voor de analyse zelf, hun korte maten creëren uitdagingen. Voor genoom-brede miRNA screening, zijn er drie gemeenschappelijke miRNA profilering technieken om uit te kiezen: microarrays, qPCR, en next-generation sequencing. Elke techniek kan worden uitgevoerd met meerdere verschillende platforms en verschillende monster preparaten vereist, elk met verschillende risico introduceren artefacten. In miRNA microarray, wordt een dia gespot of gesynthetiseerd met duizenden oligonucleotiden. Deze oligonucleotiden worden gebruikt als probes, en elk van de probes is ontworpen om te hybridiseren met een bepaalde miRNA sequentie. De monstervoorbereiding voor microarrays, zoals uitgevoerd in deze studie, eerst verrijkt voor miRNAs en introduceert dan Cy5 en Cy3 etikettering op de miRNAs. Microarray geeft de mogelijkheid om de relatieve expressieniveaus van een groot aantal genen gelijktijdig waar te nemen, is snel en geschikt voor het screenen van grote aantallen monsters, maar kan alleen analyseren van de sequenties aanwezig op de microarray en bijvoorbeeld geen veranderingen detecteren onbekende of gemuteerde miRNAs. Microarray analyse zoals uitgevoerd in dit protocol vereist ook relatief grote hoeveelheden, ongeveer 5 ug totaal RNA per monster voor analyse. Lage dichtheid qPCR miRNA profilering vereist minder materiaal (700 ng / monster en repliceren), en zorgt voor de detectie en kwantificering van miRNAs. Transcriptniveaus kan worden bepaald, en de hoeveelheid kan een absoluut bedrag of een relatieve hoeveelheid zijn. qPCR analyse eerste vereist omzetting van miRNA in cDNA, hier met behulp van een lusprimer voor elke specifieke miRNA zorgen voor de analyse van slechts volwassen miRNA. Dit genereert een langere sjabloon dat kan worden geamplificeerd onder toepassing van een miRNA-specifieke voorwaartse primer en een reverse universele primer complementair aan de lus sequentie en kan de opname van een Dual Gelabelde Probe voor specificiteit haven. qPCR kan worden gebruikt in een lage dichtheid format waar honderden miRNAs kan worden gedetecteerd in parallel via een of meer 384-puts platen met individuele primerparen in elk putje 11. Nieuwe generatie sequencing, daarentegen, is de enige van deze technieken maakt de ontdekking van nieuwe, gemuteerde of bewerkt miRNAs, aangezien alle RNA in een monster kan worden gesequenced 11. Deze techniek vereist echter meerdere stappen te kleine RNA verrijken en produceren een klein RNA bibliotheek met meerdere stappen linker ligaties en zuiveringen latere verhoogde risico moduleren hun relatieve expressieniveaus tussen monsters. Het vereist ook aanzienlijke bioinformatics analyse. Gezien de verschillende technieken voor miRNA profilering, de meest geschikte techniek is afhankelijk van de toepassingen. Microarrays zijn het meest geschikt als materiaal is relatief overvloedig en de rente is om differentiële expressie van reeds bekende miRNAs definiëren. Low-density qPCR arrays meest geschikt wanneer er een beperkte hoeveelheid monster beschikbaar is en een hoge gevoeligheid van laag expressie miRNAs vereist. Sequencing is het meest geschikt wanneer het analyseren van onbekende miRNAs, gemuteerd of verschillende isovormen van een miRNA vereist.
In de studie van oestrogeen-gereguleerde miRNAs bij borstkanker, zijn twee model cellijnen gebruikt, T47D en MCF7, waar grote hoeveelheden RNA zijn direct beschikbaar. Elke cellijn werd geanalyseerd in gerepliceerde celculturen met behulp van verschillende passages, elk in technische replica van de behandeling. Dit zorgt voor een robuuste detectie van reproduceerbaar, ERa-gereguleerde miRNAs. Relatieve miRNA expressie niveaus werden vergeleken met behulp van zowel miRNA microarray enDual gelabelde probes – lage dichtheid arrays (DLP-LDA) en gevalideerd de resultaten met specifieke qPCR met behulp van zowel cyaninekleurstof en DLP chemie. miRNA reglementen werden vervolgens verder geanalyseerd in tijdreeksen om hun exacte regelgeving na verloop van tijd, die kunnen helpen differentiëren willekeurige of circadiane variaties van oestrogeen-geïnduceerde regelgeving, en geven aan primaire effecten van secundaire effecten te definiëren. Bioinformatical vergelijkingen met chromatine-bindende studies van ERa steun kunnen verder in de differentiatie van primaire versus secundaire effecten. De test resulteerde in een betrouwbare beoordeling van miRNA regelgeving waar het kon worden vastgesteld dat na 24 uur E2 behandeling eiwit-coderende transcripten werden gemakkelijk geregeld, maar volwassen miRNAs werden niet beïnvloed 1. Het is echter mogelijk dat miRNAs worden geregeld op latere tijdstippen, zoals in de tijdreeksanalyse geselecteerde miRNAs 1. De gegevens moeten verder worden verkend en het protocol hier gepresenteerde biedt een Robust manier om hormonale regulatie van de volwassen miRNAs bij borstkanker cellijnen te bestuderen.
Bepaling het mechanisme voor hormonale regulatie van miRNA in borstkankercellen een platform voor het begrijpen van deze ziekte en kunnen potentiële behandeling voor borstkanker geven. Het kweken van deze cellen om de optimale conditie voor hormoonwerking voorzien is heel belangrijk. Hier is een protocol dat ervoor zorgt dat het hormoon van belang (oestrogeen) werd uitgesloten voordat de behandeling en dat een optimale dosering van E2 werd gebruikt voor een geschikt moment tijdens de behandeling beschreven. Andere hormonale en groeifactoren effecten werden minimaal gehouden door geleidelijke vermindering van de serum niveaus en met DCC-FBS, die FBS die zijn ontdaan van de meeste hormonen, cytokinen en groeifactoren. Fenolrood-vrij medium werd verder gebruikt om andere nonhormonal te minimaliseren, aangezien fenolrood is gemeld oestrogene activiteit en invloed bepaalde functies in cellijnen 20,21. De tijd van blootstelling van de cellen aan het hormoon van groot belang. Voor-oestrogeen verbonden regulatie van genen, is eerder aangetoond dat 24-hrexposure produceren significante respons van direct doelwit genen in borstkankercellen 1,18. Aangezien miRNAs worden getranscribeerd door RNA polymerase II, zoals mRNA, is het denkbaar dat dit een geschikt tijdstip om directe regulering ook van miRNAs te detecteren. Het moet nog bepaald worden of en hoe deze miRNAs invloed op de expressie van deze bekende ER doelen in borstkankercellen.
miRNA expressie profilering kan een uitdaging zijn vanwege de relatief geringe omvang van de miRNA, het feit dat de volwassen miRNA-sequentie kan ook worden gevonden in de pri-miRNA en de pre-miRNA, en vanwege heterogeniteit in hun GC-gehalte 22. Verschillende technieken en chemische profilering zijn gebruikt om dit probleem te overwinnen. Onder deze zijn verschillende benaderingen van microarray en qPCR analyse (figuur 2). Hoewel microarray algemeen wordt aanvaard voor hele genoom analelyse, het kan valse negatieven bieden en er bestaan verschillen tussen de beschikbare platformen, variërend van de chemie aan de printtechnologie 23. Ook het normalisatieproces een uitdaging bij de analyse van de relatief weinig miRNA genen, die worden gerekend in duizenden opzichte van tienduizenden mRNA transcripten. qPCR, daarentegen, is gevoeliger en beter toegepast wanneer minder genen worden beschouwd. Wanneer uitgevoerd in grote platen met 384 putjes, met slechts een technische repliceren per plaat, moeten meerdere platen worden geanalyseerd voor elk monster die de analyse kostbaar maakt. Ook, in onze handen, veel meer valse negatieve resultaten werden verkregen met de DLP-LDA analyse vergeleken met de microarray. Aangezien de rijpe miRNA sequentie aanwezig in de pri-miRNA en de pre-miRNA sequenties, is het van belang onderscheid te maken tussen deze transcripten met behulp van PCR-technieken 24. DLP sondes zijn ook beschikbaar voor pre-miRNAs, en specifieke primers kunnen worden ontworpen om verschillende rijpe of precursor varianten met Cyanine kleurstof qPCR technologie uitsluiten.
qPCR is een gouden standaard voor de validatie van differentiële expressie van profiling resultaten. De effectiviteit van de qPCR is echter afhankelijk van verschillende parameters waaronder RNA extractie RNA integriteit (kwaliteit), cDNA-synthese primer ontwerp, detectiewerkwijze (chemie), en de referentie-gen voor gegevensnormalisatie 1,22,25. De opties voor primer ontwerp voor miRNA analyse is zeer beperkt, aangezien de korte miRNA reekslengte geen ruimte te geven voor veel alternatieve primer ontwerp, en slechts een primer kan worden gekoesterd in deze korte reeks. Vandaar de nood aan alternatieve manipulaties zoals geïllustreerd in figuur 2. Technische herhalingen zijn belangrijk voor robuustheid van de amplificatie werkwijze en het toegepaste proces valideren. Biologische herhalingen nodig zijn voor een weergave van de algemene biologische variation, inclusief variabele reactie op behandeling ligand, en tonen dat effecten waargenomen in een cel reproduceerbaar. Gebaseerd op onze ervaring, kunnen variaties in miRNA expressie tussen celculturen optreden. Meestal zijn deze verschillen minder dan 1,3-maal, en het gemiddelde van de waarden en de bijbehorende SD identificeert de natuurlijke en technologische variatie. Deze variatie kan resulteren uit verscheidene factoren, waaronder, celdichtheid en dat celfuncties kunnen veranderen van passage tot passage. Statistisch significante aanduidingen die voortkomen uit ligand behandeling identificeren, een algemeen aanvaarde betekenis is wanneer de p-waarde minder dan 0,05. Hier zijn een student t-test op biologische en technische replicaten met de tweezijdige distributie en twee steekproeven ongelijke variantie parameters gebruikt. Andere t-testparameters bestaan, en de keuze hangt af van de experimentele opstelling 26.
Een gedetailleerd protocol bij het evalueren van de hormonale regeling van volwassen miRNA in borstkankercellen is verstrekt. Belangrijke technologieën en chemie in profilering en valideren van deze miRNA uitdrukkingen zijn duidelijk uitgelegd. De gekozen voor studies van miRNA in borstkankercellen technologie hangt uiteindelijk af van wat er precies wordt onderzocht.
The authors have nothing to disclose.
We zijn dankbaar voor Dr Xiaolian Gao, Universiteit van Houston, voor het verstrekken van advies aan de LC Sciences miRNA microarray platform, Dr Karin Edvardsson, Karolinska Institute, Zweden, en Dr Eylem Aydogdu, Universiteit van Houston, voor hun miRNA deskundigheid delen . Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health Award onder nummer R01CA172437. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Texas Emerging Technology Fund, onder de Overeenkomst niet. 300-9-1958.
DMEM | Life Technologies | 11885092 |
F12 | Life Technologies | 11765054 |
FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 |
phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 |
Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment |
DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 |
PBS tablet | Medicago, Accurate chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) |
17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML |
T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) |
T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 |
Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) |
Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 |
100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 |
Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 |
Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 |
RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 |
Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 |
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) |
All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA |
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 |
MicroAmp Fast 96-Well reaction plate | Life Technologies | 4346906 |
Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 |
2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 |
7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 |
μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) |
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 |
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 |
SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 |
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 |
10X DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA |
20X DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |