Östrojen ve mikroRNA'lar hem aracılığıyla sinyal Moleküler meme kanseri gelişiminde ve büyümesinde önemli olan. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan östrojen reseptörleri aktive eder. Pek çok transkripsiyon faktörleri microRNA ekspresyonunu düzenleyen ve estrojen ile düzenlenen microRNA farklı büyük ölçekli teknikler kullanılarak profilli olabilir.
Östrojen meme bezi gelişimi ve meme kanseri ilerlemesinde önemli rol oynar. Bu bağlanarak ve östrojen reseptörleri (ER), ERα ve ERβ aktive ederek işlevini aracılık eder. ERα sık meme kanserinde yukarı-regüle ve meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını tahrik eder. ER transkripsiyon faktörleri olarak işlev gören ve gen ekspresyonunu düzenler. Protein kodlayan genlerin ERα en düzenleme köklü Oysa, MicroRNA (miRNA) noncoding onun düzenlenmesi az araştırılmıştır. miRNA'ların kendi çeviri inhibe ya da mRNA yıkımı, genlerin transkripsiyon sonrası düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. miRNA'ların onkogen veya tümör baskılayıcı olarak işlev görebilir ve aynı zamanda biomarkerlerin umut vericidir. Mevcut miRNA deneyleri arasında, mikroarray ve kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) yaygın miRNA seviyelerini belirlemek ve ölçmek için kullanılmıştır. Göğüs kanseri, th östrojen sinyal düzenlenir miRNA'lar tanımlamakERα pozitif meme kanseri hücre hatlarında EIR ekspresyonu karşılaştırıldı önce ve sonra problar düşük yoğunluklu diziler Etiketli μParaflo-mikroakışkan mikrodizileri ve çift her ikisini de kullanarak bir östrojen aktivasyonu. Sonuçlar Sondalar-tabanlı kimya Etiketli Siyanin boya bazlı ve Dual ikisini de uygulayarak, belirli qPCR deneyleri kullanılarak valide edildi. Bundan başka, bir zaman noktası deney zamanla düzenlemeleri tespit etmek için kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan miRNA deney yaklaşımının avantajları daha da sınırlı miktarda numune ile, çok sayıda numune olgun miRNA düzenlemelerin hızlı bir tarama kılmasıdır. Özel hücre kültürü için koşulları ve östrojen tedavisi, biyolojik ve teknik çoğaltır ve büyük ölçekli tarama dahil olmak üzere düzeni, ayrı teknikleri kullanılarak derinlemesine onaylarını takiben, miRNA düzenlemelerin sağlam tespitini sağlamaktadır ve yanlış pozitif ve diğer eserler ortadan kaldırır. Birincil ve öncü transkript leve Ancak, mutasyona uğramış veya bilinmeyen miRNA'ların, veya yönetmeliklerl, tespit edilmez. Burada sunulan yöntem estrojen aracılı miRNA düzenlemenin ayrıntılı bir soruşturma temsil eder.
Östrojen meme bezi gelişimi sırasında önemli bir hormondur. Östrojen, ayrıca, meme kanseri 1 geliştirilmesi, bakım, risk ve tedavisinde önemli bir rol oynar. Östrojen transkripsiyon faktörleri olan ve belirli bir hedef genleri düzenleyen Erler, bağlanarak fonksiyonunu uygular. İki reseptör türevleri arasında, ERα meme kanseri hücrelerinin östrojen bağımlı çoğalması için gereklidir. En çok meme kanserleri ERα-pozitif ve büyüme için östrojen bağlıdır. Bu estrojen sinyal yapılan ve hormon-reseptör pozitif göğüs kanserinin tedavisi için bir hedef ERα gelmiştir. ERα yatan mekanizmayı anlamak, tedavi sonuçlarını iyileştirmek tedaviye direnci aşmak ve meme kanseri nasıl gelişeceğini anlamak önemlidir.
miRNA'ların nedeniyle transkripsiyon sonrası gen düzenlenmesinde bunların büyük etkisi hücre fonksiyonları kritik rol oynamaktadır. miRNA'ların 19-24 nükleotid kısa, tek iplikliİlk birincil miRNA transkript (pri-miRNA) içine RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonu noncoding RNA. Bunlar, kısa saç tokası ön-miRNAs (ön miRNA) içine drosha ile çekirdekte işlenir ve daha sonra Dicer ile işlenir ve sitoplazmada olgun miRNA'lar oluşturulması için tek lifler halinde ayrılır. Tek şeritli olgun miRNAs RISC kompleks oluşturmak için proteinlerin Argonaute aktarılır. Daha sonra, miRNAs çeviri bloke veya hedef mRNA 2 ayrıştırmaları transkripsiyon sonrası düzenleme için önemli bir hedef mRNA'nın 3'-tercüme edilmemiş bölgeleri (3'-UTR) hibridize olabilir.
Nedeniyle östrojen ve miRNA'ların hem normal veya bozulmuş östrojen sinyalizasyon ile ilgili miRNA'lar belirlenmesi, tümör gelişiminde oynadığı önemli role kalkınma anlayışımızı geliştirmek ve meme kanseri tedavisini geliştirmek için önemlidir. ERα protein kodlama genleri düzenleyen nasıl iyi bir anlayış, uzantısı olsave RNA düzenlemeler noncoding detayları iyice araştırılması gerekmektedir. Meme kanseri hücre hatlarında miRNA ERα düzenleme aydınlatmak amaçlayan ilk çalışmalar, aynı hücre çizgisi 3-6 analiz edilmiş olsa bile, çelişkili sonuçlar vermiştir. Bu değişen tedaviler, biyolojik varyasyonlar, farklı tekniklerin kullanımı ve miRNA'ların küçük boyutlu analiz onları zor hale gerçeğinin bir sonucu olabilir. Burada, varyasyonlar ve yöntem eserler için denetleyen bir protokol tarif edilir.
MiRNAs Östrojen tarafindan düzenlenen belirlemek için, ERα aktivitesinin iyi tanımlanmış bir meme kanseri modeli profil bir ilk adımdır. Çeşitli hücre çizgileri klinik göğüs kanserlerinin çoğunda benzer östrojen bağımlı insan ERα-pozitif göğüs kanseri tümörlerinin, elde edilmiştir. ERα ve alt hedefin ekspresyonu dahil olmak üzere bu hücre hatları iki, T47D ve MCF7, moleküler özellikleri,progesteron hormon reseptörü (PR), estrojen-duyarlı ve lümen-epitelial farklılaşma genlerin sentezlenmesi ile birlikte zar reseptör HER2 ifade eksikliği, göğüs tümörlerinin 7-10 luminal alt tipi için model olarak kullanılabilir olmasını sağlar. 17β-estradiol (E2) östrojen baskın şeklidir ve ERα optimal transkripsiyonel aktivasyonu için konsantrasyonları ve zaman noktaları çok çalışmalarda karakterize edilmiştir. 24 saat boyunca bu protokol, 10 nM E2 tedavisinde, göğüs kanseri hücrelerinin 1 ERα aktivitesi için model olarak kullanılmış ve T47D ve MCF7 edilir. Buna ek olarak, zaman-bağımlı miRNA düzenlemeler, özellikle örneğin 1-72 saatlik bir zaman aralığı içinde analiz edilebilir.
İkincisi, analiz miRNA nedeniyle kısa boyutlarda kısmen, ayrı zorlukları vardır. Düzenli Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA çökeltmeler yapılan veya zaman zaman miRNA'ların sıra toplam RNA hazırlık korunmaz standard sütun saflaştırma kullanılır. Özel önlemler korumak veya RNA'lar küçük kısmıyla zenginleştirmek için alınması gerekir. Santrifüj (-80 ° C) önce sıcaklığının düşürülmesi, izopropanol hacminin artırılması ve% 70 etanol içinde yıkama vermemek suretiyle, miRNA'ların tutma çökeltme sırasında artırılabilir. Ya da, miRNA içeren toplam RNA, yüksek kaliteli ve sağlam hazırlanması için özel bir sütun ve tamponlar da kullanılabilir. Ayrıca analizinin kendisi için, kendi kısa boyutları zorluklar yaratır. Mikroarrayler, qPCR, ve yeni nesil dizileme: genom miRNA taraması için, üç ortak seçim teknikleri profil miRNA vardır. Her teknik eserler tanıtılması farklı riskleri ile her biri, çok sayıda değişik platformlar kullanarak gerçekleştirilebilir ve farklı örnek preparatları gerekmektedir. MiRNA mikroarray, bir slayt benekli veya oligonükleotidlerden binlerce sentezlenir. Bu oligonükleotidler prob olarak kullanılır ve her bir probs, belirli bir miRNA sekansına hibridize için tasarlanmıştır. Bu çalışmada yapılan gibi mikrodizilerde numune hazırlama, ilk miRNAs için zenginleştirir ve daha sonra miRNAs üzerine Cy5 ve Cy3 etiketleme tanıttı. Mikrodizi, aynı zamanda bir gen çok sayıda göreceli ekspresyon seviyelerini gözlemek için fırsat verir, hızlı ve örneklerin çok sayıda taranması için uygundur, fakat sadece mikrodizi üzerindeki diziler mevcut analiz edebilir ve örneğin değişiklikleri algılamaz bilinmeyen veya mutasyona uğramış miRNA'ların. Bu protokolde olduğu gibi gerçekleştirilir Mikro-dizi analizi, aynı zamanda analiz için bir örnek için toplam RNA, nispeten büyük miktarlarda, yaklaşık 5 ug gerektirir. Düşük yoğunluklu QPCR miRNA profil daha az malzeme (700 ng / numune ve çoğaltmak) gerektirir ve miRNA'ların saptanması ve nicelenmesi için izin verir. Transkript seviyeleri tespit edilebilir, ve bir miktar mutlak miktarı veya göreceli bir miktar olabilir. QPCR analizi, ilk olarak bir ilmek kullanarak burada, CDNA'ya miRNA dönüştürülmesini gerektirirsadece miRNA olgun analizini sağlayarak her özel miRNA için primer. Bu, miRNA spesifik ileri primeri ve ilmekli dizisine tamamlayıcı olan bir evrensel ters primeri kullanılarak amplifiye edilebilir uzun bir şablon oluşturur ve özgüllük için bir çift etiketli Probe dahil liman olabilir. QPCR miRNAs yüzlerce her bir oyuk 11 içinde ayrı ayrı primer çiftleri ile bir ya da 384-kuyucuklu plakalar kullanılarak paralel olarak tespit edilebilir bir düşük yoğunluklu bir biçimde kullanılabilir. , Bir örnekteki tüm RNA 11 dizilebilir gibi gelecek nesil dizileme, diğer yandan, roman, mutasyona uğramış veya düzenlenmiş miRNA'ların keşfedilmesine olanak sağlar, bu tekniklerin sadece. Bu teknik, bununla birlikte, küçük RNA'ların zenginleştirmek ve numuneler arasında göreli ekspresyon seviyelerini modüle edilmesi için geliştirilmiş daha sonra riskleri ile bağlayıcı ligasyonu ve saflandırma çeşitli adımlar kullanılarak küçük bir RNA bir kütüphane üretilmesi için birden fazla aşama gerektirir. Aynı zamanda, önemli ölçüde bioinformati gerektirircs analizi. MiRNA profilleme için çeşitli teknikler göz önüne alındığında, en uygun tekniği uygulamalarına bağlıdır. Malzeme oldukça bol ve faiz zaten bilinen miRNA'ların diferansiyel ifadeyi tanımlamak için zaman Mikrodiziler en uygundur. Örnek sınırlı bir miktarda mevcuttur ve düşük ifade miRNAs yüksek bir hassasiyet gerektiği zaman düşük yoğunluklu QPCR diziler en uygun olanlardır. Dizi, mutasyona uğramış bilinmeyen miRNAs veya miRNA farklı izoformlarının analizi gerekli olduğunda en uygundur.
Göğüs kanseri östrojen düzenlenmiş miRNA'ların çalışmada iki modeli hücre hatları, RNA'nın büyük miktarlarda kolaylıkla temin edilebilir T47D ve MCF7, kullanılır. Her bir hücre hattı bir tedaviye teknik tekrardan değişik yollarını, her kullanılarak yinelenmiş hücre kültürlerinde incelenmiştir. Bu tekrarlanabilir, ERα düzenlenmiş miRNA'ların sağlam tespiti için izin verir. Bağıl miRNA ifade seviyeleri miRNA mikrodizisi ve her ikisini de kullanarak karşılaştırıldıÇift etiketli problar – düşük yoğunluklu diziler (DLP-LDA) ve siyanin boyası ve DLP kimyasallar her ikisini de kullanarak belirli QPCR ile sonuçları teyit etti. miRNA düzenlemeler daha sonra östrojen kaynaklı düzenlemelerin rastgele veya sirkadiyen varyasyonlarını ayırt yardımcı ve ikincil etkilerinden birincil etkilerini gösterebilir zamanla onların tam düzenleme, tanımlamak için zaman serisi analiz edildi. ERα kromatin-bağlanma çalışmaları ile Biyoinformatik karşılaştırmalar ikincil etkilerin karşı birincil ayrımında yardım daha fazla olabilir. Tahlil, 24 saat tedavi E2 protein-kodlayan transkriptleri sonra kolaylıkla düzenlenir, ancak olgun miRNAs 1 etkilenmediği kurulamadığı MiRNA düzenlemeler güvenilir bir değerlendirme ile sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, seçilen miRNAs 1'in zaman serisi analizinde gösterildiği gibi miRNAs, daha sonraki zaman noktalarında düzenlenir mümkündür. Detayları ek araştırılması gerekir ve burada sunulan protokol Robus sağlarmeme kanseri hücre hatlarında olgun miRNA'ların hormonal regülasyonu incelemek için t yolu.
Meme kanseri hücrelerinde miRNA hormonal düzenlenmesi için mekanizma belirlenmesi, bu hastalığın anlaşılması için bir platform sağlayan ve göğüs kanseri için potansiyel bir tedavi sağlayabilir. Hormon hareket için en uygun durum sağlamak için bu hücrelerin kültürlenmesi çok önemlidir. Burada, E2'nin bir uygun doz tedavi süresince uygun bir süre için kullanılmıştır tedavi öncesi ve ilgi (östrojen) hormon dahil olduğu sağlayan bir protokol tarif edilmiştir. Diğer hormonal ve büyüme faktörü etkisi giderek serum seviyesini düşürerek ve hormon, sitokinler ve büyüme faktörlerinin çoğu soyulmuş edilmiş FBS olan DCC-FBS kullanarak en azından tutuldu. Fenol kırmızı içermeyen ortam ayrıca fenol kırmızı estrojenik aktiviteye sahip olan ve hücre çizgileri 20,21 belirli fonksiyonları etkilediği bildirilmiştir göz önüne alındığında, diğer hormonal olmayan etkileri en aza indirmek için kullanılmıştır. Hormona hücrelerin maruz kalma süresi büyük önem taşımaktadır. Genlerinin östrojen ile ilişkili düzenleme için, bir önceki 24 hrexposure göğüs kanseri hücrelerinin 1,18 doğrudan hedef genlerin önemli bir cevap üretmek gösterilmiştir. MiRNAs RNA polimerazı II tarafından transkribe olduğu için, mRNA gibi, bu aynı zamanda miRNAs doğrudan düzenleme tespit etmek için uygun bir zaman noktası olduğunu akla uygundur. Bu miRNAs meme kanseri hücrelerinde bu bilinen ER hedeflerin ifadesini nasıl etkilediğini ve henüz belirlenecek.
MiRNA ekspresyon profili nedeniyle miRNA, olgun miRNA dizisi pri-miRNA ve önceden miRNA de bulunabilir gerçeği göreli küçük boyutta zor olabilir, ve bu nedenle bunların GC içeriği 22 heterojenliğin olabilir. Çeşitli profilleme teknikleri ve kimyaları bu zorluğu aşmak için istihdam edilmiştir. Bunlar arasında mikroarray ve qPCR analizi farklı yaklaşımlar (Şekil 2). Mikrodizi yaygın tüm genom anal kabul edilmekle birlikteölçmeye çalıştığımız, bu yanlış negatifler sağlayabilir ve kimya baskı teknolojisi 23 arasında değişen, mevcut platformlar arasında farklılıklar vardır. MRNA onbinlerce kıyasla binlerce sayılır nispeten az miRNA genlerinin, analiz ederken de normalleşme sürecinin bir meydan okuma sunuyor. QPCR, diğer taraftan, daha duyarlıdır ve daha az genler dikkate alınması gereken zaman daha iyi uygulanır. Plaka başına sadece bir teknik tekrarında, geniş, 384 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir Ancak, birden fazla plakalar analiz pahalı hale getirir, her numune için analiz edilmesi gerekir. Ayrıca, bizim ellerde, daha birçok yanlış negatif sonuçlar mikroarray göre DLP-LDA analizi kullanılarak elde edilmiştir. Olgun miRNA dizisi pri-miRNA ve önceden miRNA dizileri içinde mevcut olduğu göz önüne alındığında, bu PCR teknikleri kullanarak bu transkript 24 arasında ayırt etmek için önem taşımaktadır. DLP sondalar ön miRNA'lar ve sp için de kullanılabilirecific primerleri siyanin boyası QPCR teknolojisi kullanılarak varyantları farklı olgun ya da ön-maddesini çıkarmak için tasarlanabilir.
QPCR sonuçları profilleme ayırıcı ifade doğrulama için bir altın standarttır. QPCR etkinliği, ancak, RNA ekstraksiyonu, RNA bütünlüğü (kalite), cDNA sentezi, primer tasarımı, saptama yöntemi (kimya) ve veri normalleştirme 1,22,25 için referans gen dahil olmak üzere çeşitli parametrelere bağlıdır. Kısa miRNA dizi uzunluğu kadar alternatif primer dizaynı için yer vermez beri miRNA analizi için primer dizaynı için seçenekler çok sınırlı ve sadece bir primer bu kısa sırayla barındıran olabilir. Bu nedenle, alternatif manipülasyonlar için ihtiyaç, Şekil 2'de gösterildiği gibi. Teknik çoğaltır amplifikasyon yöntemin sağlamlığını ve kullanılan işlemi doğrulamak için önemlidir. Biyolojik çoğaltır genel biyolojik variatio bir temsili için gerekli olann tedavi ligand için, ve bir hücrede görülen etkileri tekrarlanabilir olduğunu göstermek için değişken yanıt dahil. Bizim deneyime dayalı, hücre kültürleri arasındaki miRNA ifade varyasyonlar oluşabilir. Genellikle bu fark 1.3-kat daha az olan, ve değerlerin ortalaması ve ilgili SD doğal ve teknolojik varyasyonu tanımlar. Bu varyasyon, hücre yoğunluğu ve hücre fonksiyonları geçide pasajdan değişebilir olmasından, dahil olmak üzere çeşitli faktörler neden olabilir. P-değeri 0.05 'den daha az olduğu zaman ligand tedaviden kaynaklanan istatistiksel olarak anlamlı ifadeleri belirlemek için, yaygın olarak kabul edilen bir önem arz eder. Burada, iki kuyruklu dağılımı ve iki örnek eşit olmayan varyans parametreleri kullanarak biyolojik ve teknik suretin bir öğrencinin t-testi kullanılmıştır. Diğer t-test parametreleri var, ve seçim deney düzeneği 26 bağlıdır.
Olgun miR hormonal düzenlemeleri değerlendirirken ayrıntılı bir protokolMeme kanseri hücrelerinde NA sağlanmıştır. Profilleme ve bu miRNA ifadeleri doğrulayarak önemli teknolojileri ve kimya açıkça açıklanmıştır. Meme kanseri hücrelerinde miRNA çalışmalar için seçilmiştir teknoloji sonunda tam olarak araştırılmaktadır bağlıdır.
The authors have nothing to disclose.
Biz onların miRNA uzmanlık paylaşımı için Dr Karin Edvardsson, Karolinska Enstitüsü, İsveç, ve Dr Eylem Aydoğdu, Houston Üniversitesi,, LC Bilimleri miRNA mikroarray platformu tavsiye sağlamak için, Dr Xiaolian Gao, Houston Üniversitesi minnettarız . Bu yayında bildirilen Araştırma Ödülü Numarası R01CA172437 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Bu çalışma aynı zamanda Anlaşma kapsamında Teksas Gelişen Teknoloji Fonu, hiçbir hibe tarafından desteklenmiştir. 300-9-1958.
DMEM | Life Technologies | 11885092 |
F12 | Life Technologies | 11765054 |
FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 |
phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 |
Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment |
DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 |
PBS tablet | Medicago, Accurate chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) |
17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML |
T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) |
T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 |
Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) |
Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 |
100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 |
Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 |
Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 |
RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 |
Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 |
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) |
All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA |
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 |
MicroAmp Fast 96-Well reaction plate | Life Technologies | 4346906 |
Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 |
2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 |
7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 |
μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) |
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 |
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 |
SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 |
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 |
10X DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA |
20X DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |