Molekulare Signal sowohl durch Östrogen und microRNAs sind entscheidend bei Brustkrebs Entwicklung und Wachstum. Östrogen aktiviert die Östrogen-Rezeptoren, die Transkriptionsfaktoren sind. Viele Transkriptionsfaktoren die Expression von microRNAs regulieren und Östrogen-regulierten microRNAs kann mit verschiedenen Groß Techniken profiliert werden.
Östrogen spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Brustdrüse und Brustkrebs Progression. Es vermittelt seine Funktion durch die Bindung an und Aktivierung der Östrogenrezeptoren (ERs), &agr; und &bgr;. ERa häufig bei Brustkrebs hochreguliert und treibt die Proliferation von Brustkrebszellen. Die ERS funktionieren, wie Transkriptionsfaktoren und die Genexpression regulieren. Während ERa die Regulierung der Protein-kodierenden Gene gut etabliert ist, ist die Regulierung der nicht-kodierenden microRNA (miRNA) weniger erforscht. miRNAs spielen eine wichtige Rolle in der Post-Transkriptionsregulation von Genen, die Hemmung der Translation oder Beeinträchtigung der mRNA. miRNAs können als Onkogene oder Tumor-Unterdrücker funktionieren und werden auch vielversprechende Biomarker. Unter den miRNA-Assays zur Verfügung, haben Microarray-und quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) wurde ausgiebig genutzt, um nachzuweisen und zu quantifizieren miRNA Ebenen. Um miRNAs durch Östrogen-Signalisierung bei Brustkrebs, th geregelt identifiziereneir Ausdruck in ERa-positiven Brustkrebs-Zelllinien wurden im Vergleich vor und nach Östrogen-Aktivierung unter Verwendung sowohl der mikrofluidischen μParaflo-Microarrays und Dual-markierten Sonden-Arrays geringer Dichte. Die Ergebnisse wurden mit spezifischen qPCR-Assays validiert, die Anwendung sowohl Cyanine Farbstoff-und Dual-markierten Sonden-basierten Chemie. Weiterhin wurde ein Zeitpunkt, Assay verwendet werden, um Vorschriften über die Zeit zu ermitteln. Vorteile der miRNA-Assay-Ansatz in dieser Studie verwendet wird, ist, dass es ermöglicht ein schnelles Screening von reifen miRNA Regelungen in zahlreichen Proben, auch mit begrenzten Probenmengen. Das Layout, einschließlich der spezifischen Bedingungen für die Zellkultur-und Östrogen-Behandlung, biologische und technische Replikate und Groß Screening gefolgt von eingehenden Bestätigungen über separate Techniken sorgt für eine robuste Detektion von miRNA-Vorschriften, und eliminiert Fehlalarme und andere Artefakte. Allerdings mutiert oder unbekannte microRNAs oder Vorschriften am Primär-und Vorläufer Transkript level, werden nicht erkannt. Das hier vorgestellte Verfahren stellt eine gründliche Untersuchung der Östrogen-vermittelte miRNA Regulierung.
Östrogen ist ein Hormon, das in der Brustdrüse Entwicklung wichtig ist. Östrogen spielt auch eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Wartung, Risiken und Behandlung von Brustkrebs ein. Östrogen übt seine Funktion durch die Bindung an ERs, die Transkriptionsfaktoren und regulieren spezifischer Zielgene. Der zwei Rezeptorvarianten ist ERa wichtig für Östrogen-abhängigen Proliferation von Brustkrebszellen. Die meisten Brustkrebserkrankungen sind ERa-positiven und hängt von Östrogen für Wachstum. Dies hat Östrogen Signal gemacht und ERa ein Ziel für die Behandlung in der Hormonrezeptor-positivem Brustkrebs. Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen von ERa ist wichtig, um die Behandlungsergebnisse zu verbessern, zu überwinden Widerstand gegen die Behandlung, und verstehen, wie Brustkrebs sich entwickelt.
miRNAs spielen eine entscheidende Rolle in der Zellfunktionen aufgrund ihrer großen Einfluss in posttranskriptionale Genregulation. miRNAs sind 19-24 Nukleotide kurze, einsträngige, Nicht-kodierende RNAs, die zuerst von RNA-Polymerase II in primäre miRNA-Transkripte (pri-miRNA) transkribiert werden. Sie sind im Kern mit Drosha in kurze Haarnadel-Vorläufer-miRNAs (pre-miRNA) verarbeitet und dann durch Dicer verarbeitet und in Einzelstränge getrennt, um zu reifen miRNAs im Zytoplasma bilden. Die Einzelstrang-reifen miRNAs sind Argonaut-Proteine übertragen, um RISC-Komplex zu bilden. Dann können die miRNAs an die 3'-nicht-translatierten Bereichen (3'-UTR) eines Ziel-mRNA zu hybridisieren, die zu post-transkriptionellen Regulation durch Blockieren Übersetzung oder einer Verschlechterung der Ziel-mRNA 2.
Aufgrund der wichtigen Rolle, die sowohl Östrogen und miRNAs spielen bei der Tumorprogression, die Identifizierung miRNAs mit normalen oder gestörten Östrogen-Signalisierung zugeordnet ist, um unser Verständnis der Entwicklung und zur Verbesserung der Behandlung von Brustkrebs wichtig. Zwar gibt es eine gutes Verständnis, wie &agr; reguliert Protein-kodierende Gene, die Ausweitungund nicht-kodierenden RNA-Details Vorschriften bleibt, gründlich untersucht werden. Erste Studien mit dem Ziel, ERa Regulierung der miRNA in Brustkrebs-Zelllinien aufzuklären haben widersprüchliche Ergebnisse erbracht, auch wenn die gleiche Zelllinie wurde analysiert 3-6. Dies kann eine Folge der unterschiedlichen Behandlungen, biologische Variationen, die Verwendung von verschiedenen Techniken, und die Tatsache, dass die geringe Größe der miRNAs machen sie schwierig zu analysieren. Hier ist ein Protokoll, das für Variationen und Verfahren Artefakte steuert beschrieben.
Um festzustellen, welche miRNAs werden durch Östrogen reguliert wird, ist Profilierung eines gut definierten Brustkrebsmodell von ERa Aktivität ein erster Schritt. Mehrere Zelllinien aus menschlichen &agr;-positiven Brustkrebstumoren, die abhängig von Östrogen ähnlich der Mehrzahl der klinischen Mammakarzinome erzeugt. Die molekularen Eigenschaften von zwei dieser Zellinien T47D-und MCF7, einschließlich der Expression von ER &agr; und seinem stromabwärtigen Ziel,das Hormon Progesteron-Rezeptor (PR), eine fehlende Expression von Membran-Rezeptor HER2, zusammen mit der Expression von Östrogen-responsive-und Lumen epitheliale Differenzierung Gene, machen sie als Modell für die luminalen Subtyp von Brusttumoren 7-10 geeignet. 17β-Östradiol (E2) ist die vorherrschende Form von Östrogen, und die Konzentrationen und Zeitpunkte für optimale Transkriptionsaktivierung von ER &agr; wurden in mehreren Studien charakterisiert. In diesem Protokoll 10 nM E2-Behandlung für 24 Stunden als Modelle für ERa Aktivität in Brustkrebszellen ein und verwendet T47D und MCF7. Darüber hinaus kann zeitabhängig miRNA gesetzlichen Bestimmungen in einem Zeitintervall von z. B. 1-72 Stunden analysiert werden.
Zweitens hat die Analyse miRNA separaten Herausforderungen, zum Teil aufgrund ihrer kurzen Größen. miRNAs sind nicht gut in der Gesamt-RNA Vorbereitung erhalten, wenn regelmäßig Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA-Ausscheidungen durchgeführt werden, oder wenn standard Spalte Reinigungen verwendet. Vorsichtsmaßnahmen müssen getroffen werden, zu halten oder zu bereichern für die kleinere Fraktion der RNAs. Indem das Volumen an Isopropanol, das Absenken der Temperatur vor der Zentrifugation (-80 ° C), und das Weglassen des Wasch in 70% Ethanol, kann das Halte von miRNAs während der Fällung gesteigert werden. Oder Sie können bestimmte Spalten und Puffer für eine qualitativ hochwertige und robuste Herstellung von miRNA-haltigen Gesamt-RNA verwendet werden. Auch für die Analyse selbst, ihre Short-Größen zu erstellen Herausforderungen. Für genomweite Screening-miRNA, gibt es drei gemeinsame miRNA Profiling-Techniken zur Auswahl: Microarrays, qPCR und Next-Generation-Sequenzierung. Jede Technik kann durchgeführt werden unter Verwendung von mehreren unterschiedlichen Plattformen und verschiedene Probenpräparationen benötigt werden, mit jeweils unterschiedlichen Risiken der Einführung Artefakte. In miRNA-Microarray ist ein Schieber entdeckt oder synthetisiert mit Tausenden von Oligonukleotiden. Diese Oligonucleotide als Sonden verwendet werden, und jede der Sondens ist entworfen, um auf eine bestimmte miRNA-Sequenz hybridisieren. Die Probenpräparation für Mikroarrays, wie in dieser Studie durchgeführt, anreichert ersten miRNAs und führt Cy5 und Cy3 Kennzeichnung auf die miRNAs dann. Mikroarray gibt die Möglichkeit, die relativen Expressionsniveaus von einer großen Anzahl von Genen gleichzeitig zu beobachten, schnell und geeignet für das Screening einer großen Anzahl von Proben, sondern nur auf dem Microarray-Analyse der Sequenzen vorhanden und wird zB nicht Änderungen erfassen unbekannte oder mutierte miRNAs. Microarray-Analyse, wie in diesem Protokoll durchgeführt erfordert auch relativ große Mengen, etwa 5 ug Gesamt-RNA pro Probe für die Analyse. Low-Density-qPCR miRNA Profilierung erfordert weniger Material (700 ng / Probe und zu replizieren), und erlaubt die Detektion und Quantifizierung von miRNAs. Transkriptionsniveaus bestimmt werden, und die Menge kann eine absolute Menge oder relative Menge sein. qPCR-Analyse erfordert zunächst Umwandlung von miRNA in cDNA, hier durch die Verwendung eines gelooptenPrimer für jede spezifische miRNA Gewährleistung der Analyse von nur reife miRNA. Dies erzeugt eine Vorlage, die mehr verstärkt wird, unter Verwendung einer miRNA-spezifischen Vorwärtsprimer und einen universellen Rückwärtsprimer komplementär zu der verknüpften Abfolge werden und kann die Aufnahme eines Doppel-markierten Sonde für Spezifität beherbergen. qPCR in einer Low-Density-Format, bei dem Hunderte von miRNAs können parallel mit einem oder mehreren 384-Well-Platten mit verschiedenen Primer-Paare in jeder gut 11 erfasst werden verwendet werden. Next-Generation-Sequenzierung, auf der anderen Seite, ist die einzige von diesen Techniken, die für die Entdeckung von neuen, mutierten oder bearbeitet miRNAs ermöglicht, da alle RNAs in einer Probe 11 sequenziert werden. Diese Technik erfordert jedoch mehrere Schritte, um kleine RNAs bereichern und erzeugen einen kleinen RNA-Bibliothek unter Verwendung mehrerer Stufen von Linker-Ligationen und Reinigungen mit anschließender verbessert Risiken der Modulation ihrer relativen Expressionsniveaus zwischen den Proben. Es erfordert auch erhebliche bioinformatics-Analyse. Angesichts der verschiedenen Techniken für die miRNA-Profiling richtet sich die am besten geeignete Technik für die Anwendungen. Microarrays sind am besten geeignet, wenn Material ist relativ reichlich vorhanden und das Interesse ist es, unterschiedliche Expression von bereits bekannten miRNAs zu definieren. Low-Density-qPCR-Arrays sind am besten geeignet, wenn eine begrenzte Menge der Probe vorhanden ist und eine hohe Empfindlichkeit niedrig exprimierten miRNAs erforderlich. Die Sequenzierung ist am besten geeignet, wenn die Analyse von unbekannten miRNAs, mutiert oder verschiedene Isoformen eines miRNA erforderlich.
In der Studie von Östrogen-regulierten miRNAs bei Brustkrebs sind zwei Modellzelllinien verwendet, T47D-und MCF7, wo große Mengen an RNA zur Verfügung stehen. Jede Zelllinie wurde in replizierten Zellkulturen mit verschiedenen Durchgängen, die jeweils in den technischen Wiederholungen der Behandlung analysiert. Dies ermöglicht eine robuste Detektion von reproduzierbar, &agr;-regulierten miRNAs. Relative miRNA-Expressionsniveaus wurden sowohl mit miRNA-Microarray und verglichenDual-markierten Sonden – Arrays niedriger Dichte (DLP-LDA) und validiert die Ergebnisse mit spezifischen qPCR mit sowohl Cyanin-Farbstoff-und DLP-Chemie. miRNA-Vorschriften wurden dann weiter in Zeitreihen analysiert, um ihre genaue Regelung über die Zeit, die Ihnen helfen, zu unterscheiden zufällig oder circadianen Schwankungen von Östrogen-induzierte Vorschriften, und zeigen primären Auswirkungen von Nebenwirkungen zu definieren. Bioinformatische Vergleiche mit Chromatin-Bindungsstudien von ERa kann Hilfe bei der Differenzierung von primären gegenüber Sekundäreffekte fördern. Der Test ergab eine zuverlässige Beurteilung der miRNA-Vorschriften, wenn nachgewiesen werden kann, dass nach 24 Stunden Behandlung E2 Protein-kodierenden Transkripte wurden leicht reifen miRNAs reguliert, aber waren nicht betroffen 1. Es ist jedoch möglich, dass miRNAs zu späteren Zeitpunkten reguliert, wie in der Zeitreihenanalyse von ausgewählten miRNAs 1 gezeigt. Die Details müssen noch weiter erforscht werden und das hier vorgestellte Protokoll bietet eine Robust Möglichkeit, hormonellen Regulation der reifen miRNAs in Brustkrebs-Zelllinien untersucht werden.
Bestimmen der Mechanismus für die hormonelle Regulation der miRNA in Brustkrebszellen können eine Plattform für das Verständnis dieser Krankheit bereitstellen und mögliche Behandlung für Brustkrebs ist. Kultivieren dieser Zellen, um die optimalen Bedingungen für die Hormonwirkung bereitzustellen ist sehr wichtig. Hier ist ein Protokoll, das sicherstellt, dass das Hormon von Interesse (Östrogen) ausgeschlossen wurde vor der Behandlung und, dass eine optimale Dosis von E2 wurde für eine geeignete Zeit, während der Behandlung verwendet wurde beschrieben. Und andere hormonelle Wachstumsfaktor Effekte auf ein Minimum durch die schrittweise Senkung der Serumwerte und unter Verwendung von DCC-FBS, die FBS, die von den meisten seiner Hormon, Zytokine und Wachstumsfaktoren abgestreift worden ist, gehalten wird. Phenolrot-freien Medien wurde weiter verwendet, um andere hormonelle Effekte zu minimieren, da Phenolrot wurde berichtet, dass östrogene Aktivität auswirken und bestimmte Funktionen in Zelllinien 20,21. Die Zeit der Exposition der Zellen gegenüber dem Hormon ist von großer Bedeutung,. Für Östrogen-assoziierte Regulation von Genen hat sich bereits gezeigt, dass 24-hrexposure produzieren signifikante Reaktion der direkten Zielgene in Brustkrebszellen 1,18. Da miRNAs werden durch RNA-Polymerase II transkribiert, wie mRNAs, ist es denkbar, dass dies ein geeigneter Zeitpunkt, um direkte Regulierung auch von miRNAs zu erkennen. Es ist noch nicht bestimmt werden, ob und wie diese miRNAs beeinflussen die Expression von diesen bekannten ER Ziele in Brustkrebszellen.
miRNA-Expressionsprofiling kann aufgrund der relativ geringen Größe der miRNA, die Tatsache, dass die reife miRNA-Sequenz kann auch in der pri-miRNA und der pre-miRNA gefunden werden eine Herausforderung sein, und wegen der Heterogenität in ihrer GC-Gehalt 22. Mehrere Profilierungstechniken und Chemien verwendet worden, um diese Schwierigkeit zu überwinden. Unter diesen sind verschiedene Ansätze von Mikroarrays und qPCR-Analyse (Fig. 2). Obwohl Microarray ist weithin bekannt für gesamte Genom anal akzeptiertlyse, kann es falsch negative bieten und es gibt Unterschiede zwischen den verfügbaren Plattformen, angefangen von der Chemie auf die Drucktechnik 23. Auch die Normalisierungsprozess stellt eine Herausforderung bei der Analyse der relativ wenigen miRNA Gene, die im Vergleich zu den Zehntausenden von mRNA-Transkripten in Tausenden gezählt werden. qPCR, auf der anderen Seite, ist empfindlicher und besser angewendet, wenn weniger Gene zu berücksichtigen. Wenn sie jedoch in großen 384-Well-Platten durchgeführt, wobei nur eine technische replizieren pro Platte, müssen mehrere Platten für jede Probe, die das Analyse kostspielig macht analysiert werden. Auch in unseren Händen, viele andere falsch-negative Ergebnisse wurden unter Verwendung der DLP-LDA-Analyse im Vergleich zu dem Microarray erhalten. Da die reife miRNA-Sequenz in der pri-miRNA und der pre-miRNA-Sequenzen vorhanden ist, ist es von Interesse, zwischen diesen Transkripte mittels PCR-Techniken 24 unterscheiden. DLP-Sonden sind auch für Pre-miRNAs und specific Primer können auch entworfen werden, um verschiedene reifen oder Vorläufer-Varianten mit Cyaninfarbstoff qPCR-Technologie auszuschließen.
qPCR ist ein goldener Standard für die Validierung der differentiellen Expression von Profiling-Ergebnisse. Die Wirksamkeit der qPCR jedoch hängt von mehreren Parametern, einschließlich RNA-Extraktion, RNA-Integrität (Qualität), cDNA-Synthese, Primer-Design, Nachweisverfahren (Chemie) und dem Referenz-Gen für die Datennormierung 1,22,25. Die Optionen für die Primer-Design für die miRNA-Analyse ist sehr begrenzt, da der Kurz miRNA-Sequenzlänge nicht viel Raum zu geben für alternative Primer-Design, und nur eine Grundierung kann in dieser kurzen Sequenz gehegt werden. Daher besteht die Notwendigkeit für alternative Manipulationen, wie in Fig. 2 dargestellt. Technische Wiederholungen sind wichtig, um die Robustheit des Verstärkungsverfahren und das verwendete Verfahren zu validieren. Biologische Replikate für eine Darstellung der allgemeinen biologischen e Variation erforderlichn einschließlich variabler Reaktion auf die Behandlung Ligand und um zu zeigen, dass die Auswirkungen in einer Zelle zu sehen sind reproduzierbar. Basierend auf unserer Erfahrung können Schwankungen in miRNA-Expression zwischen Zellkulturen auftreten. Normalerweise werden diese Unterschiede sind weniger als das 1,3-fache, und der Durchschnitt der Werte und entsprechende SD identifiziert den natürlichen und technologischen Variation. Diese Variation kann von verschiedenen Faktoren ab, die Zelldichte und die Tatsache, dass Zellfunktionen können von Kanal zu Kanal ändern führen. Um statistisch signifikante Ausdrücke aus Liganden-Behandlung entstehenden identifizieren, ist eine allgemein anerkannte Bedeutung, wenn der p-Wert kleiner als 0,05 ist. Hier ein Student-t-Test auf den biologischen und technischen Replikate mit der two-tailed Verteilung und zwei Stichproben ungleicher Varianz-Parameter verwendet wurden. Andere T-Testparameter vorhanden sind, und die Wahl hängt von den experimentellen Aufbau 26.
Ein detailliertes Protokoll bei der Bewertung hormonelle Vorschriften der reifen miRNA in Brustkrebszellen bereitgestellt wurden. Wichtige Technologien und Chemie in der Profilerstellung und Validierung dieser miRNA Ausdrücke sind klar erläutert. Die für die Untersuchung der miRNA in Brustkrebszellen gewählte Technologie hängt letztlich davon ab, was genau untersucht.
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar, dass Dr. Gao Xiaolian, Universität Houston, für die Beratung der LC Sciences miRNA-Microarray-Plattform, Dr. Karin Edvardsson, Karolinska Institut, Schweden, und Dr. Eylem Aydogdu, Universität Houston, für den Austausch von Know-how ihrer miRNA . Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl R01CA172437 unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Diese Arbeit wurde auch durch Zuschüsse aus dem Texas Emerging Technology Fund, unter Vertrag unterstützt. 300-9-1958.
DMEM | Life Technologies | 11885092 |
F12 | Life Technologies | 11765054 |
FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 |
phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 |
Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment |
DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 |
PBS tablet | Medicago, Accurate chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) |
17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML |
T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) |
T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 |
Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) |
Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 |
100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 |
Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 |
Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 |
RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 |
Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 |
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) |
All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA |
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 |
MicroAmp Fast 96-Well reaction plate | Life Technologies | 4346906 |
Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 |
2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 |
7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 |
μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) |
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 |
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 |
SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 |
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 |
10X DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA |
20X DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |