O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

O timo é o órgão em que o desenvolvimento de células T ocorre. O seu tamanho relativo e absoluto diminui com a idade, quando se torna sucessivamente substituído por gordura, embora a actividade do timo pode ainda ser detectado na velhice. A sua importância para a resposta imune foi demonstrado na década de 1960 ^1.

O repertório de células T é formada através da interacção dos receptores de células T com complexos de peptídeo-MHC em diferentes tipos de APC do timo, que fornecem sinais de sobrevivência ou morte para o desenvolvimento de células T, resultando em um repertório de células T funcionais e são amplamente auto-tolerante ^2.

Aproximadamente 98% das células do timo humano estão a desenvolver células T referidos como timócitos. Os restantes 2% são constituídos por um número de diferentes tipos de células, incluindo uma variedade de TCE (cortical, medular, subcapsular), mielóide e plasmocitï DC (MDC, pDC), macrófagos, células B, células T re-circulação maduras, granulócitos, fibroblasts, células endoteliais e células epiteliais muito raras com um fenótipo de expressão semelhante ao de células de outros tecidos tais como o músculo, os neurónios e epitélio respiratório (Figura 1). Destes, TEC e DC são os principais tipos de APC encontrados em um timo normal. Nos últimos anos, a purificação destes tipos da APC para a cultura e perfil molecular ganhou mais e mais interesse. Devido à sua baixa frequência, o isolamento de qualquer um destes tipos de células para análise detalhada requer um processo eficiente, reprodutível e de baixo custo. O método aqui apresentado é uma modificação a partir de estudos publicados anteriormente ^3,4.

Tal como acontece com qualquer outro tecido, extracção a partir de células do timo pode ser conseguida por via enzimática a desagregar-célula e redes de interacção célula-matriz, a fim de obter uma suspensão de células individuais. Existem certos parâmetros, como uma boa eficiência de dissociação, o rendimento celular, viabilidade celular e retenção de célula smarcadores urface que são cruciais e devem ser otimizados para o isolamento de sucesso destas populações de células raras.

Neste protocolo, o isolamento de DC e subconjuntos TEC é realizada através de uma suspensão de uma única célula do tecido por perturbação mecânica e de digestão enzimática. Usamos colagenase A de Clostridium histolyticum, que tem uma proporção equilibrada de diferentes actividades enzimáticas, para quebrar o colagénio nativo que mantém o tecido em conjunto. ADNase I está incluído na solução de enzima para reduzir a agregação das células, devido a ADN isento de células mortas (timócitos são muito sensíveis). Também proporcionam uma abordagem alternativa para a digestão enzimática do tecido típica envolve o tratamento de tecidos mecânica e enzimática assistida por um Dissociator tecido. A suspensão de célula única é então sujeito a uma única centrifugação de densidade de Percoll para o enriquecimento da fracção de baixa densidade (LDF) de células. A partir desta fracção de células, DC pode ser isolado através de coloração fou DC marcadores de superfície (isto é, CD11c ⁺⁾ e utilizando separação magnética ou de células activadas por fluorescência (FACS). Ao contrário das células linfóides que compreendem a maioria das células no timo, o TEC não expressam CD45 em níveis elevados, mas são positivas para a adesão da célula epitelial molécula EpCAM. CTECs pode ser distinguido do TCE medular pela expressão de um antigénio ainda indefinido reconhecido pelo CDR-2 (dendrítica reticulócitos-2 cortical) de anticorpo ^{de 4,5} e um pouco menor expressão EpCAM. O diferencial de co-expressão de EpCAM e CDR2 permite o isolamento eficaz desses subconjuntos TEC através de células de elevada velocidade de triagem ^6.

O protocolo aqui apresentado é otimizado para o tecido do timo humano. A duração do processo depende da quantidade de tecido e a capacidade do experimentador, bem como a velocidade do classificador de células, se for utilizado separação FACS. Normalmente, o protocolo para o isolamento de DC pode ser concluída dentro de 5Hr -6 e para o isolamento do TCE em 8-10 horas. O isolamento de DC e subconjuntos do TEC a partir de tecido do timo é sensível ao tempo. Quanto mais rápido o processo de isolamento, a melhor o estado das células. Finalmente, as células isoladas podem ser utilizadas para outras investigações, como estudos comparativos de ARNm e a expressão da proteína, as experiências de PCR, o isolamento da proteína, o perfil molecular (isto é, transcritômica, análise de micro RNA), assim como a cultura de ⁶ células.

Declaração de Ética

A fim de ser capaz de trabalhar com o tecido do timo humano o pesquisador precisa obter a aprovação do comitê de ética local ou autoridades responsáveis, bem como um consentimento informado por escrito do doador (ou geralmente seus pais, uma vez que o tecido é geralmente obtida a partir de menor de idade crianças). Além disso, todos os tecidos humanos devem ser tratadas como sendo devem ser tomadas medidas potencialmente infecciosas e apropriados, tais como trabalhar com luvas, etc.