Summary

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Published: February 12, 2014
doi:

Summary

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Abstract

Nöritler, hem dendrit ve aksonlar, nöronlar arasındaki elektriksel uyarıların iletimini sağlayacak nöronal hücresel süreçleri vardır. Neurites yapısının tanımlanması, bu işlemler, sinaptik iletişim destek malzemeleri ve sinyalleri nasıl hareket anlamak için çok önemlidir. Elektron mikroskopisi (EM) geleneksel nevritlerin içindeki ultrastrüktürel özellikleri değerlendirmek için kullanılmıştır, ancak dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücüye maruz kalma yapıları bozabilmektedir. Önemli bir karşılanmamış hedefi böyle eserler etkilenmez yapısal değerlendirmeler için izin prosedürlerin oluşturulmasıdır. Burada, biz büyüyen ve kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ile muayene ile takip elektron mikroskobu ızgaraları farklı primer nöronlar flaş dondurma bütün nevrotiler için detaylı ve tekrarlanabilir bir protokol kurduk. Bu teknik asse kolaylaştıran, nanometre çözünürlükte donmuş, hidratlı neurites 3-D görselleştirme sağlarmorfolojik farklılıklar ssment. Bizim protokol dorsal kök ganglion (DRG) nevritler ve onların yakın yerli devlet hipokampal neurites bir görselleştirme görülmemiş bir görünüm verir. Gibi, bu yöntemlerin normal nöronlar ve nörolojik bozukluklar etkilenenlerin hem neurites gelecek çalışmalar için bir temel oluşturabilir.

Introduction

Nöronlar alt nöronlar ile iletişim kurmak için bilgi ve aksonlar, genellikle oldukça uzun, almak için dendrit detaylandırılması, merkezi ve periferal sinir sistemlerinin işlev için karmaşık devre esasını kurmak. Nörit gelişimi, sinir sisteminin eleştirel işlevini destekleyen embriyonik gelişim ve nöronal farklılaşma ve neurites bakımı sırasında temel bir rol oynamaktadır. Nöritik işlemleri de nöronal hasar ve rejenerasyon, hem de sinir sistemi bozukluklarında kritik bulunmaktadır. Nöronal mimari çalışma hem normal ve hastalıklı beyin anlamak için çok önemlidir. Neyse ki, fizyolojik olarak ilgili nöronal hücre kültürü sistemleri karmaşık ve heterojen hücre yapıları özetlemek için mevcuttur. Katı deneysel platformlarda, nöronal morfoloji kalitatif ve kantitatif analizleri sağlayacak etkili görselleştirme stratejileri aydınlatılması dayanarak ihtiyaç vardır. Özellikle yararlı olurnanometre ölçeğinde nevritlerle, hem akson ve dendrit görselleştirmek için tutarlı bir platform sağlar ayrıntılı bir metodoloji.

Geleneksel elektron mikroskobu gerçek durumundan örneklerinde bozulmalara neden olabilir ki, dehidrasyon ve reçine yerleştirmesi sırasında organik çözücünün kullanılmasını gerektirir. Böylece bulgular 4,9,25 yorumlanmasını sınırlayıcı – Bugüne kadar, nanometre ölçeğinde en fazla yapısal karakterizasyon gibi sert kimyasallara maruz kalan daha büyük hücrelere veya dokulara dayanmaktadır. Ayrıca, elektron ışını penetrasyon için, 1 mikron kesit 12 daha büyük olan bir kalınlık arzeden organizma veya hücre uzantılar için gereklidir. Nihayet, neurites uzatılmış özelliği hantal tanımı yaparak, ayrık dilim özgü veri setleri toplama doku sonuçları kesitli veya öğütülmüş. Hatta cryo-EM için, bir dondurulmuş, hidratlanmış numune kesit mümkün olduğu, yöntem, sıkıştırma artif getirmektedir1, hareket eder.

Son yıllarda, araştırmacılar EM ızgaraları ve flaş dondurma sonradan cryo-ET 8,10,18,23 kullanarak nevritlerle görselleştirmek için sıvı etan onları doğrudan hipokampal nöronlar büyümeye nasıl öğrendim. Ancak, bu tür çalışmalar, bir ısmarlama cihaz 10,23, ya da rutin görselleştirme 8,18 için yeterince ince vitreus buz üretmek için kurutma adım eksikliği bilgilerini kullanın ya. Örneğin, bir çalışma EM ızgara 10 lekeleme için 30-40 sn kullanılmasını önerir, ancak bu değer genel kullanım için optimize edilmiş değil ama bu ölçüye dalma-dondurma cihaz için özeldir. Dalma-dondurma örnek öncesinde nem korumak için özel yapılmış bir cihaz yerine piyasada mevcut bir 17 Kullanımı yaygın tekrarlanabilirlik için bir engel teşkil edebilir.

Bu çalışmalar Cryo-ET tarafından nevritlerle görselleştirme çığır olsa da, biz ap keşfetmek için bir adım daha almışnöronal numuneler (hipokampal ve dorsal kök ganglion nöronlarının) çeşitli cryo-ET plicability. Ayrıca, optimal ve optimal sonuçları yanı sıra, böyle bir numune için kriyo-ET kullanarak karşılaşabileceği potansiyel eserler hem de tartışmak.

Yakın bir yerli devlet korunması ve nanometre ölçeğinde bütün nevritlerle görselleştirmek için detaylı bir teknik tanımlama ultrastrüktürel çalışmalar yürütmek için daha fazla araştırmacılar için yeteneğini geliştirmek olacaktır. Bu amaçla, nevritler görselleştirmek için sabitlenmemiş, boyanmamış nöronlar hazırlamak için ticari olarak temin edilebilen ekipman kullanılarak etkili ve detaylı bir protokol açıklar. Bu sağlıklı neurites ultrastrüktürünü detaylandırma ve yapısal farklılıkları sinir sistemi hastalık modellerinde mevcut ne anlamak için zemin hazırlamaya yönelik önemli bir ilk adımdır. Cryo-ET nanometre ölçeğinde 3-D sabitlenmemiş, boyanmamış nörit özelliklerini çözebilirsiniz yana, yöntem mümkün asla gibi olacaktır yapacaknevritik mimarisini 12 tanımlamak için fore.

Protocol

1.. Kaplama İlköğretim Nöronlar EM Izgaralara Yemekleri Hazırlama En az 25X büyütmede ışık mikroskobu kullanarak altın EM ızgaraları holey karbon bütünlüğünü inceleyin. Emin karbon delikleri>% 98 sağlam olduğundan emin olun. Birincil nöronları kaplama için, EM ızgaraları alev sterilize ve aynı anda onları hidrofilik işlemek için bir Bunsen beki kullanın. Kenarıyla değil, merkezi ızgarah alanı ile EM ızgara almak için cımbız kullanın. DİKKAT: gözetimsiz ya…

Representative Results

Önceki cryo-ET ile dondurma ve görüntüleme için, ışık mikroskobu ve görüntüler nöronlar üzerinde büyüdüğü EM ızgaranın alınmalıdır. Nöritler birbirleri ile önemli örtüşme olmaksızın açıkça görünür olmalıdır. Şekil 3A'da renkli bir kutu büyütüldüğünde nevrotiler ızgara kafes boyunca uzandığı Şekil 3B, daha yüksek büyütme göstermek için bir alanı temsil eder. Her ızgara-kare nöronlar ve onların nevritlerle destekleyen bir hole…

Discussion

Biz sıçan embriyonik nöronlar (dorsal kök ganglion ve hipokampus) altın, elektron mikroskobu (EM) ızgaralar üzerinde büyümüş ve 2-D cryo-EM ve 3-D kriyo-kullanarak görüntülü onların neurites için yeterince ince vitreus buz donmuş olabileceğini göstermektedir ET. Hipokampal nevrotiler önceden kriyo-ET 8,10,18,23 kullanarak görüntülü olsa da, bir protokol eksik olmuştur piyasada mevcut cihazlar kullanılarak başarılı çoğaltma için yeterince ayrıntılı. Araştırma hipokampal ne…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma NIH hibe (PN2EY016525 ve P41GM103832) tarafından desteklenmiştir. SHS Gulf Coast Konsorsiyum (NIH Hibe No T32EB009379) Disiplinlerarası Biyobilim Eğitim WM Keck Merkezi'nin Nanobiyoloji Disiplinlerarası Lisansüstü Eğitim Programı bir burs ile desteklenmiştir.

SHS, disseke büyüdü ve DRG ve hipokampus hücrelerini vitrifiye, cryo-EM ve DRG ve hipokampal akson kriyo-ET toplanan verileri, yeniden ve tilt serisi renk açıklamalı. MRG disseke ve MnR laboratuarında hipokampal hücreleri sağladı. SC tilt serisi açıklama destekli. SHS nöronlar incelemek ve büyümeye nasıl CW tarafından eğitildi. SHS, WCM ve WC deneyler tasarlanmıştı. SHS diğer yazarlar girişi ile el yazması hazırladı.

Bu video t Biozentrum Hücresel Görüntüleme ve NanoAnalytics (C-Cina) için Merkezi'nde çekildiÜniversite Basel diye. C-Cina Basel, İsviçre'de bulunan ETH Zürich arasında Biyosistem Bilimi ve Mühendisliği (D-BSSE) için Bölümü entegre edilmiştir.

Materials

Dumont #7 Tweezers Electron Microscopy Sciences 72803-01 For handling EM grids
Glass bottom dishes MatTek Corp. P35G-1.5-10C For growing sample
Electron microscopy grids Quantifoil Holey Carbon, Au 200, R 2/2 For growing sample
Calcium-free filter paper Whatman 1541-055 For blotting sample
Large flat point long tweezers Excelta Corporation E003-000590, 25-SA For blotting sample
Vitrification device and tweezers FEI Vitrobot Mark III For freezing sample
Mini grid storage boxes Ted Pella, Inc. 160-40 For storing EM grids
Cryo transfer holder Gatan 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder For imaging samples
Semi-automated tilt series acquisition software SerialEM http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ For imaging samples
Image processing software IMOD eTomo http://bio3d.colorado.edu/imod/ For image processing
Transmission electron microscope for cryoEM JEOL, Tokyo 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope For imaging samples
4k x 4k CCD camera Gatan N/A For imaging samples
3-D annotation software Visage Imaging GmbH Amira/Avizo For processing 3-D data
Software for digitally stitching 2-D images Adobe Adobe Photoshop For processing 2-D data
DMEM, High Glucose Invitrogen 11965-118 For hippocampal culture
Boric acid Sigma Aldrich B-0252 For hippocampal culture
Sodium tetraborate Sigma Aldrich B-9876 For hippocampal culture
Poly-L-lysine Sigma Aldrich P2636-500MG For hippocampal culture
Filter system Corning 430758 For hippocampal culture
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049 For DRG culture
B-27 supplement Invitrogen 17504-044 For DRG culture
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 For DRG culture
Glutamax Invitrogen 35050-061 For DRG culture
Recombinant rat b-NGF R&D Systems 556-NG For DRG culture
Uridine Sigma U3003-5G For DRG culture
5'-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma F0503-100MG For DRG culture
Matrigel BD Biosciences 356234 For DRG culture

Referenzen

  1. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
  2. Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
  3. Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
  4. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  5. Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
  6. DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
  7. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
  8. Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
  9. Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
  10. Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
  11. Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
  12. Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
  13. De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
  14. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  15. Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
  16. Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
  17. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  18. Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
  21. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  22. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
  23. Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
  25. Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
  27. Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
  28. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
  29. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
  30. Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
  31. Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
  32. Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
  33. Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
  34. Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
  35. Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
  36. Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neurowissenschaften. 108, 493-506 (2001).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Shahmoradian, S. H., Galiano, M. R., Wu, C., Chen, S., Rasband, M. N., Mobley, W. C., Chiu, W. Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (84), e50783, doi:10.3791/50783 (2014).

View Video