Summary

Подготовка первичных нейронов для визуализации нейриты в Frozen-гидратной государства Использование крио-электронной томографии

Published: February 12, 2014
doi:

Summary

Чтобы сохранить нейрональные процессы ультраструктурным анализа, мы опишем протокол для обшивки первичных нейронов по электронной микроскопии сеток с последующей флэш замораживания, получая образцы взвешенных в слое стекловидного льда. Эти образцы могут быть рассмотрены с крио-электронного микроскопа для визуализации структуры в нанометровом масштабе.

Abstract

Невриты, оба дендриты и аксоны, являются нейронные клеточные процессы, которые позволяют проведение электрических импульсов между нейронами. Определение структуры нейритах имеет решающее значение для понимания того, как эти процессы перемещения материалов и сигналов, которые поддерживают синаптическую связь. Электронная микроскопия (ЭМ) традиционно используется для оценки ультраструктурные особенности в рамках невриты, однако воздействие органического растворителя при дегидратации и смолы вложения могут исказить структур. Важным неудовлетворенная целью является разработка процедур, позволяющих структурных оценок не пострадавших от таких артефактов. Здесь мы создали подробную и воспроизводимый протокол для выращивания и флеш-замораживания целые нейриты различных первичных нейронов на электронной микроскопии сетей с последующим их рассмотрения с крио-электронной томографии (крио-ET). Эта техника позволяет 3-D визуализации замороженных гидратированных нейритах на нанометровым разрешением, облегчая Assessment их морфологических различий. Наш протокол дает беспрецедентный вид на спинной ганглий корень (DRG) невриты, а также визуализации гиппокампа нейритах в их почти родной государства. Как таковые, эти методы создают основу для будущих исследований по нейритах обеих нормальных нейронов и страдающих от неврологических расстройств.

Introduction

Нейроны установить сложных схем, необходимых для функции центральной и периферической нервной системы по разработке дендриты получать информацию и аксоны, часто довольно длительным, общаться с вниз по течению нейронов. Рост нейритов играет фундаментальную роль в процессе эмбрионального развития и дифференцировки нейронов и поддержания нейритах поддерживает критически функцию нервной системы. Нейритных процессы также имеют критически нейронов травмы и регенерации, а также нервной системы. Изучение нейронов архитектуры важно понять как нормальную и больного мозга. К счастью, физиологически соответствующие нейронные системы клеточных культур существуют, которые могут повторять сложные и гетерогенных клеточных структур. На основе выяснения твердых экспериментальных площадок, эффективных стратегий визуализации, которые позволяют качественный и количественный анализ нейронной морфологии необходимы. Особенно полезно будетбыть подробная методология, которая обеспечивает согласованную платформу для визуализации нейриты, как аксонов и дендритов в нанометровом масштабе.

Традиционный электронная микроскопия требует использования органического растворителя в процессе дегидратации и смолы вложения, которые могут вызывать искажения в образцах от их истинное положение. На сегодняшний день большинство структурные характеризации в нанометровом масштабе основаны на больших клеток или тканей, которые подвергаются таких агрессивных химикатов – таким образом, ограничивающих интерпретацию результатов 4,9,25. Кроме того, для проникновения электронного пучка, секционирование требуется для организмов или клеточных выступов, обладающих толщину большую, чем 1 мкм 12. Наконец, срезы или измельченный результаты тканей в набор дискретных срез конкретных наборов данных, что делает обременительным определение удлиненного элемента нейритов. Даже для крио-ЭМ, в котором секционирования с замороженными гашеной образец можно, метод вводит сжатия Artifдействует 1.

В последние годы исследователи научились выращивать гиппокампа нейронов непосредственно на развивающихся сетей и вспышкой замораживания их в жидком этана впоследствии визуализировать нейриты помощью крио-ET 8,10,18,23. Тем не менее, такие исследования или использовать на заказ устройство 10,23, или отсутствие детали на промокательной шага для создания достаточного тонкий стекловидный лед для рутинной визуализации 8,18. Например, в одном исследовании рекомендует использовать 30-40 сек для декантации EM сетки 10, однако это значение оптимизирован не для общего пользования, но является специфическим для этого заказного глубоководным заморозки устройства. Использование на заказ устройство, а не имеющийся в продаже один 17 для поддержания влажности до окунуться заморозки образца может создать препятствие для широкого воспроизводимости.

Хотя эти исследования были новаторским в визуализации нейриты на крио-ЭТ, мы взяли еще один шаг вперед, чтобы исследовать арприменимости из крио-ЭТ к различным нейронных образцов (гиппокампа и задних корешков ганглиев нейронов). Кроме того, мы рассмотрим оба оптимальные и неоптимальные результаты, а также потенциальные артефакты, которые можно было столкнуться с помощью крио-ET для таких образцов.

Определение подробную методику для сохранения и визуализации целые нейриты в нанометровом масштабе в почти родной государства должно расширить возможности для более исследователей осуществлять ультраструктурные исследования. С этой целью мы опишем эффективную и подробный протокол с использованием коммерчески доступного оборудования для подготовки нефиксированные, неокрашенные нейроны визуализировать нейриты. Это важный первый шаг к детализации ультраструктуры здоровых невриты и заложить основу для понимания того, что структурные различия присутствуют в моделях заболевание нервной системы. С крио-ЭТ может решить нефиксированные, неокрашенные особенности аксонов в 3-D в нанометровом масштабе, метод позволит как никогда бытьПоэтому, чтобы определить нейритных архитектуры 12.

Protocol

1. Подготовка Посуда с Е. М. сетям для гальванических первичных нейронов Изучите целостность дырявой углерода на золото на развивающихся сеток с использованием светового микроскопа при увеличении не менее 25X. Убедитесь углерода дыры> 98% нетронутыми. Для обшивки первичные н?…

Representative Results

До замораживания и обработки изображений с помощью крио-ЭТ, световым микроскопом изображения должны быть приняты в EM сетки, на которой нейроны растут. Нейриты должен быть отчетливо виден без существенных перекрытия друг с другом. Цветной блок на фиг.3А представляет собой обла?…

Discussion

Мы покажем, что крысы эмбриональных нейронов (спинной ганглий корень и гиппокампа) можно выращивать на золотом электронной микроскопии (ЭМ) сетках и замораживали в стекловидное льда достаточно тонкой для своих нейритах для включения в образ с помощью 2-D крио-ЭМ и 3-D крио- ET. В то время ка?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантами NIH (PN2EY016525 и P41GM103832). СВС была поддержана стипендией от подготовки выпускников Программы нанобиологии междисциплинарных из Кека Центра междисциплинарных Bioscience подготовки побережье Мексиканского залива консорциумов (NIH грант № T32EB009379).

СВС рассеченные, рос и остеклованные DRG и клеток гиппокампа; собраны крио-ЭМ и крио-ET данные DRG и гиппокампа аксонов; реконструирован и цвет-аннотированный серию наклона. MRG расчлененный и при условии, гиппокампа клетки в лаборатории МПР в. SC помощь в наклона серии аннотации. СВС обучался CW о том, как анализировать и расти нейроны. СВС, WCM и туалет задуман эксперименты. СВС подготовили рукопись с участием других авторов.

Этот фильм был снят в Центре Cellular изображений и NanoAnalytics (С-CinA) от Biozentrum третон университет Базель. С-CINA интегрирован в Департамент биосистем науки и техники (D-BSSE) от ETH Zürich, расположенный в Базеле, Швейцария.

Materials

Dumont #7 Tweezers Electron Microscopy Sciences 72803-01 For handling EM grids
Glass bottom dishes MatTek Corp. P35G-1.5-10C For growing sample
Electron microscopy grids Quantifoil Holey Carbon, Au 200, R 2/2 For growing sample
Calcium-free filter paper Whatman 1541-055 For blotting sample
Large flat point long tweezers Excelta Corporation E003-000590, 25-SA For blotting sample
Vitrification device and tweezers FEI Vitrobot Mark III For freezing sample
Mini grid storage boxes Ted Pella, Inc. 160-40 For storing EM grids
Cryo transfer holder Gatan 626 Single Tilt Liquid Nitrogen Cryo Transfer Holder For imaging samples
Semi-automated tilt series acquisition software SerialEM http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ For imaging samples
Image processing software IMOD eTomo http://bio3d.colorado.edu/imod/ For image processing
Transmission electron microscope for cryoEM JEOL, Tokyo 200-kV JEM2100 LaB6 electron microscope For imaging samples
4k x 4k CCD camera Gatan N/A For imaging samples
3-D annotation software Visage Imaging GmbH Amira/Avizo For processing 3-D data
Software for digitally stitching 2-D images Adobe Adobe Photoshop For processing 2-D data
DMEM, High Glucose Invitrogen 11965-118 For hippocampal culture
Boric acid Sigma Aldrich B-0252 For hippocampal culture
Sodium tetraborate Sigma Aldrich B-9876 For hippocampal culture
Poly-L-lysine Sigma Aldrich P2636-500MG For hippocampal culture
Filter system Corning 430758 For hippocampal culture
Neurobasal medium Invitrogen 21103-049 For DRG culture
B-27 supplement Invitrogen 17504-044 For DRG culture
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 For DRG culture
Glutamax Invitrogen 35050-061 For DRG culture
Recombinant rat b-NGF R&D Systems 556-NG For DRG culture
Uridine Sigma U3003-5G For DRG culture
5'-Fluoro-2'-deoxyuridine Sigma F0503-100MG For DRG culture
Matrigel BD Biosciences 356234 For DRG culture

Referenzen

  1. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23, 3583-3588 (2004).
  2. Benzing, W. C., Mufson, E. J., Armstrong, D. M. Alzheimer’s disease-like dystrophic neurites characteristically associated with senile plaques are not found within other neurodegenerative diseases unless amyloid beta-protein deposition is present. Brain Res. 606, 10-18 (1993).
  3. Binks, B. P. . Modern characterization methods of surfactant systems. , (1999).
  4. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr. Opin. Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  5. Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).
  6. DiFiglia, M., et al. Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science. 277, 1990-1993 (1997).
  7. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10, 55-61 (1982).
  8. Fernández-Busnadiego, R., et al. Insights into the molecular organization of the neuron by cryo-electron tomography. J. Electron Microsc. 60, 137-148 (2011).
  9. Frey, T. G., Perkins, G. A., Ellisman, M. H. Electron tomography of membrane-bound cellular organelles. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 199-224 (2006).
  10. Garvalov, B. K., et al. Luminal particles within cellular microtubules. J. Cell. Biol. 174, 759-765 (2006).
  11. Grünewald, K., Cyrklaff, M. Structure of complex viruses and virus-infected cells by electron cryo tomography. Curr. Opin. Microbiol. 9, 437-442 (2006).
  12. Gu, J., Bourne, P. E. . Structural bioinformatics. , (2009).
  13. De Hoop, M. J., Meyn, L., Dotti, C. G. Culturing hippocampal neurons and astrocytes from fetal rodent brain. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, (1998).
  14. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  15. Fink, C. C., et al. Selective regulation of neurite extension and synapse formation by the beta but not the alpha isoform of CaMKII. Neuron. 39, 283-297 (2003).
  16. Jacob, W. A., et al. Mitochondrial matrix granules: their behavior during changing metabolic situations and their relationship to contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Microsc. Res. Tech. 27, 307-318 (1994).
  17. Jensen, G. J., Briegel, A. How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).
  18. Ibiricu, I., et al. Cryo Electron Tomography of Herpes Simplex Virus during Axonal Transport and Secondary Envelopment in Primary Neurons. PLoS Pathog. 7, e1002406 (2011).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Koning, R. I., et al. Cryo electron tomography of vitrified fibroblasts: microtubule plus ends in situ. J. Struct. Biol. 161, 459-468 (2008).
  21. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
  22. Lotharius, J., Brundin, P. Pathogenesis of Parkinson’s disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 3, 932-942 (2002).
  23. Lucić, V., et al. Multiscale imaging of neurons grown in culture: from light microscopy to cryo-electron tomography. J. Struct. Biol. 160, 146 (2007).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and. 2, 152-160 (2007).
  25. Marsh, B. J. Lessons from tomographic studies of the mammalian Golgi. Biochim. Biophys. Acta. 1744, 273-292 (2005).
  26. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152, 36-51 (2005).
  27. Medalia, O., et al. Organization of actin networks in intact filopodia. Curr. Biol. 17, 79-84 (2007).
  28. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298, 1209-1213 (2002).
  29. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. J. Vis. Exp. (58), e2770 (2011).
  30. Nakatomi, H., et al. Regeneration of Hippocampal Pyramidal Neurons after Ischemic Brain Injury by Recruitment of Endogenous Neural Progenitors. Cell. 110, 429-441 (2002).
  31. Peachey, L. D. Electron Microscopic Observations on the Accumulation of Divalent Cations in Intramitochondrial Granules. J. Cell. Biol. 20, 95-111 (1964).
  32. Raza, M., et al. Aging is associated with elevated intracellular calcium levels and altered calcium homeostatic mechanisms in hippocampal neurons. Neurosci. Lett. 418, 77-81 (2007).
  33. Scroggs, R. S., Fox, A. P. Calcium current variation between acutely isolated adult rat dorsal root ganglion neurons of different size. J. Physiol. 445, 639-658 (1992).
  34. Squire, L. R. . Fundamental neuroscience. , (2003).
  35. Sulzer, D. Multiple hit hypotheses for dopamine neuron loss in Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 30, 244-250 (2007).
  36. Tapia, J. C., et al. Early expression of glycine and GABA(A) receptors in developing spinal cord neurons. Effects on neurite outgrowth. Neurowissenschaften. 108, 493-506 (2001).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Shahmoradian, S. H., Galiano, M. R., Wu, C., Chen, S., Rasband, M. N., Mobley, W. C., Chiu, W. Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (84), e50783, doi:10.3791/50783 (2014).

View Video