Summary

Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

Published: May 22, 2013
doi:

Summary

Il tessuto adiposo (AT) è un sito di attivazione delle cellule immunitarie intensa e interazione. Quasi tutte le cellule del sistema immunitario sono presenti in AT e per i rapporti sono alterati da obesità. Isolamento adeguato, quantificazione e caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella malattia immunometabolic.

Abstract

La scoperta di una maggiore infiltrazione di macrofagi nel tessuto adiposo (AT) di roditori obesi e gli esseri umani ha portato ad un intensificarsi di interesse contributo delle cellule immunitarie all'insulina locale e sistemica di resistenza. Isolamento e quantificazione delle diverse popolazioni di cellule immunitarie nel magri e obesi AT è oggi una tecnica comunemente utilizzata nei laboratori immunometabolism; ancora estrema cura deve essere presa sia in stromale isolamento delle cellule vascolari e nella analisi di citometria a flusso in modo che i dati ottenuti siano affidabili e interpretabile . In questo video mostriamo come per tritare, digerire, e isolare la frazione di cellule vascolari-arricchito stromale immune. Successivamente, mostriamo come anticorpi etichetta macrofagi e linfociti T e come correttamente cancello su di loro in esperimenti di citometria a flusso. Sono forniti di flusso rappresentativi citometria trame di basso contenuto di grassi alimentati magra e ricca di grassi nutriti topi obesi. Un elemento critico di questa analisi è l'uso di anticorpi che fannoNon fluorescenza nei canali dove AT macrofagi sono naturalmente autofluorescenti, così come l'uso di controlli di compensazione adeguati.

Introduction

Storicamente, il tessuto adiposo (AT) è stato visto come un organo inerte di stoccaggio dei lipidi, che si espande e si contrae in risposta al bilancio energetico. Ora capiamo che AT rappresenta un organo endocrino dinamica che secerne attivamente una serie di ormoni che influenzano direttamente il comportamento alimentare e l'omeostasi del glucosio sistemico. Inoltre, negli ultimi dieci anni c'è stato un crescente apprezzamento per le numerose popolazioni di cellule immunitarie che risiedono nella AT frazione stromale vascolare (SVF), così come il loro contributo alla AT omeostasi.

La possibilità di separare la AT adipociti e SVF utilizzando un collagenasi digest seguita da centrifugazione differenziale è stato descritto da Rodbell nel 1964 1. Collagenasi II è più spesso utilizzato per la separazione degli adipociti e SVF a causa di manutenzione di adipociti recettori dell'insulina 1. All'inizio, frazionamento enzimatica di AT è stato principalmente impiegato per studiare adipocyte metabolismo e per isolare preadipocytes. Più recentemente, questa tecnica, combinata con l'ampia disponibilità di citofluorimetri e il numero sempre crescente di anticorpi coniugati fluoroforo disponibili in commercio, ha facilitato la caratterizzazione di AT cellule immunitarie.

Sebbene la presenza di cellule immunitarie nella infiammato AT era stato descritto in precedenza 2, gli articoli fondamentali per Weisberg et al. e Xu et al. pubblicato nel 2003, furono i primi a documentare l'accumulo di AT macrofagi (ATM) in obesità, che secernono citochine infiammatorie e correlare con AT-specifica e sistemica insulino-resistenza 3,4. Queste osservazioni hanno fornito la base di un nuovo campo di indagine recentemente coniato, "immunometabolism," 5 e sono state seguite da studi che implicano varie popolazioni di cellule immunitarie, comprese le cellule dendritiche 6, mastociti, cellule T 7 8 –10, cellule B, cellule NKT 11 12 13, eosinofili e neutrofili 14,15 nello sviluppo dell'obesità associata resistenza all'insulina.

L'obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata della tecnica digest collagenasi utilizzata per isolare le cellule del AT SVF e caratterizzare bancomat e AT cellule T mediante citometria a flusso. Questo protocollo è stato ottimizzato per mouse, tuttavia, gli spettatori possono trarre beneficio dalla lettura di un ottimo articolo che fornisce ampi dettagli sulla ottimizzazione di questa tecnica per l'uomo a 16 anni. I destinatari di questo articolo include investigatori con limitata esperienza di lavoro con il mouse e l'esecuzione di citometria a flusso. Diverse considerazioni pratiche per il bilanciamento resa cellulare e la vitalità con il tempo e le risorse sono presentate così come controlli di citometria a flusso ottimali per la caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie. Oltre al nostro protocollo, i lettori sono referred un recente articolo JoVE da Basu et al. per una eccellente discussione di alcuni aspetti tecnici della citometria a flusso per comprendere adeguati controlli e compensazioni 17.

Protocol

1. Reagenti e accessori per la Prima di iniziare questo protocollo sperimentale, preparare i seguenti reagenti: 70% di etanolo PBS 1X 1X DPBS (senza Ca e Mg) integrati con 0,5% BSA FACS buffer: 1X DPBS (senza Ca e Mg), 2 mM EDTA, e l'1% FCS Tampone ACK: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, e 0,1 mM Na 2 EDTA in acqua 2. Raccolta e Preparazione del tessuto adiposo Eut…

Representative Results

Collagenasi digestione di AT seguito da centrifugazione differenziale è stato utilizzato per isolare il SVF da cuscinetti di grasso dell'epididimo di topi maschi C57BL/6J alimentato un basso contenuto di grassi (10% kcal dai grassi) o ad alto contenuto di grassi (60% kcal dai grassi) dieta (LFD e HFD , rispettivamente) per 16 settimane. Cellule del SVF furono poi etichettati con anticorpi primari fluoroforo-coniugato a quantificare la percentuale di vitale ATM (Figura 1) e AT cellule T (fig…

Discussion

Crescente interesse per il ruolo del sistema immunitario nelle conseguenze metaboliche dell'obesità ha portato all'uso diffuso di citometria a flusso per caratterizzare cellule immunitarie del AT. Anche se il protocollo esatto varierà tra laboratori sulla base della loro esperienza e le attrezzature disponibili, i passaggi critici includono collagenasi digestione, centrifugazione differenziale, e la cellula antigene di superficie di etichettatura. Lo scopo del presente articolo è di fornire un protocollo dett…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

OCS è supportato da un NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dalla American Diabetes Association (7-10-MI-05), e AHH è supportato da un American Heart Association Investigator Award Fondata (12EIA8270000). Esperimenti di citometria a flusso sono stati eseguiti nel VMC Citometria a Flusso risorsa condivisa. Il VMC Citometria a Flusso risorsa condivisa è supportata dalla Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

Materials

Name Company Catalog #
DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml Life Technologies 14190-250
DAPI Life Technologies D3571
BSA Sigma A2153-100G
collagenase Sigma C6885-5G
propidium iodide solution Sigma P4864-10 ml
stable stack 20 microliter Rainin SS-L10
20 microliter filter tips Rainin SRL10F
stable stack 250 microliter tips Rainin SS-L250
1000 microliter tips Rainin GPS-L1000
1000 microliter filter tips Rainin GP-L1000F
250 microliter Filter Tips Rainin SR-L200F
FC Block BD Biosciences 553142
fisher 100mn strainers Fisherbrand 22-363-549
medium weigh dish Fisherbrand 02-202B
aluminum foil Fisherbrand 1213100
mincing scissors Fisherbrand 089531B
Vortex Fisherbrand 2215365
50 ml conical tubes BD Falcon 14-959-49A
filter top FACS tubes BD Falcon 352235
10 ml pipette case 200 BD Falcon 1367520
round bottom tubes BD Falcon 352058
5 ml syringe BD Falcon 309646
V Bottom Plates Costar 07-200-107
transfer bulb pipette Thermo Scientific 13-711-22
Shaker Thermo Scientific 11 676 071
Adhesive mat Thermo Scientific 1368750
Cell Culture Centrifuge Sorvall 75253839
Adapters Sorvall 75003723
Rat anti-mouse CD16/CD32 BD Biosciences 553142 Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells
Rat anti-mouse F4/80 eBioscience 17-4801 Fluorophore conjugate: APC
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 17-4321
Rat anti-mouse CD11b eBioscience 11-0112 Fluorophore conjugate: FITC
Concentration: 0.5 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 11/1/4031
Armenian Hamster anti-mouse CD11c eBioscience 12-0114 Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: Dec-88
Goat anti-mouse MGL1/2 R&D Systems FAB4297P Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC108P
Goat anti-mouse CD206 R&D Systems FAB2535P Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC108P
Rat anti-mouse CCR2 R&D Systems FAB5538P Fluorophore conjugate: PE
Concentration: 0.1 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: IC013P
Armenian Hamster anti-mouse TCRβ BD Biosciences 553174 Fluorophore conjugate: APC
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 553956
Rat anti-mouse CD8a BD Biosciences 552877 Fluorophore conjugate: PE-Cy7
Concentration: 0.8 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 552784
Rat anti-mouse CD4 BD Biosciences 557956 Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700
Concentration: 0.2 μg/ 106 cells
Isotype control catalog number: 557963

Table 1. List of Materials and Reagents.

Referenzen

  1. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
  2. Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
  3. Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
  4. Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
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Diesen Artikel zitieren
Orr, J. S., Kennedy, A. J., Hasty, A. H. Isolation of Adipose Tissue Immune Cells. J. Vis. Exp. (75), e50707, doi:10.3791/50707 (2013).

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