Summary

No método de imagem in vivo Distinguir inflamação aguda e crônica

Published: August 16, 2013
doi:

Summary

Nós descrevemos um método de imagem não-invasivo para distinguir as fases inflamatórias. Administração sistêmica de luminol revela áreas de inflamação aguda dependentes atividade da MPO em neutrófilos. Em contraste, a injeção de lucigenina permite a visualização de inflamação crônica dependente de atividade Phox em macrófagos.

Abstract

A inflamação é um dos aspectos fundamentais de muitas doenças humanas. Neste relatório, vídeo, demonstramos técnicas de imagem de bioluminescência não-invasivos que distinguem a inflamação aguda e crônica em modelos do rato. Com o dano tecidual ou invasão do patógeno, os neutrófilos são a primeira linha de defesa, que joga um papel importante na mediação da resposta inflamatória aguda. À medida que a reacção inflamatória progride, monócitos circulantes migrar gradualmente para o local da lesão e diferenciam-se em macrófagos maduros, que medeiam a inflamação crónica e promover a reparação do tecido, removendo detritos do tecido e produzir citocinas anti-inflamatórias. A injecção intraperitoneal de luminol (,4-phthalazinedione, sal de sódio de l ,3-di-hidro-1 5-amino-2) permite a detecção de uma inflamação aguda largamente mediada por neutrófilos infiltrantes de tecidos. Luminol reage especificamente com o superóxido gerado dentro dos phagosomes de neutrófilos pois os resultados de uma bioluminescência mieloperoxidase (MPO) reacção mediada. Lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato) também reage com o superóxido para gerar bioluminescência. No entanto, lucigenina bioluminescência é independente da MPO e só depende de NADPH oxidase de fagócitos (Phox) em macrófagos durante a inflamação crônica. Juntos, luminol e lucigenina permitir a visualização não invasiva e avaliação longitudinal de diferentes populações de fagócitos em todo fases inflamatórias agudas e crônicas. Dado o papel importante da inflamação numa variedade de doenças humanas, acreditamos que este método de imagem não invasiva pode ajudar a investigar os diferentes papéis de neutrófilos e macrófagos, em uma variedade de condições patológicas.

Introduction

A inflamação é uma resposta biológica altamente regulado envolvida numa variedade de doenças humanas, incluindo uma infecção microbiana, a cicatrização de feridas 2, 3 diabetes, câncer 4, 5 cardiovascular, neurodegenerativa, 6, 7 e as doenças auto-imunes. Inflamação de tecidos requer a coordenação adequado de diversas células imunes, a fim de obter a aprovação do patógeno, reparação de tecidos, e a resolução da doença. Neutrófilos e macrófagos são mediadores imunes chaves de inflamação de tecidos. Na fase aguda da inflamação, os neutrófilos são os primeiros socorros para vários estímulos nocivos, e danos no tecido 8. Os neutrófilos extravasar rapidamente da circulação para o local da lesão, onde as células inactivar micróbios invasores, liberando grânulos anti-microbianos e fagocitose. Durante a fagocitose, neutrófilos absorvem micróbios invasores para fagossomas, dentro do qual as células produzem níveis elevados de Superoxide (O 2 · -). Superóxido phagosomal é a principal fonte de muitas espécies reativas de oxigênio a jusante (ROS). Por exemplo, pode ser dismutadas superóxido em peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) por dismutação espontânea ou pela superóxido dismutase (SOD), 9, 10. Em neutrófilos, mieloperoxidase (MPO) converte mais de peróxido de hidrogénio em ácido hipocloroso anti-microbiana (HOCl) 11. À medida que as respostas inflamatórias continuar, monócitos circulantes migrar gradualmente para o local da lesão e diferenciam-se em macrófagos maduros 2, cuja função fagocítica ajudar a remover agentes patogénicos inactivadas e restos celulares. Além disso, como um regulador chave na fase tardia da inflamação, macrófagos promove a reparação de tecidos, produzindo citocinas anti-inflamatórias 12 e por meio da geração de ROS extracelular a um nível inferior 9. O ROS gerados nesta fase depois regulam a remodelação do tecido, formação de novos vasos, e reepithelialização 13.

Fagocitário NADPH oxidase (Phox) é a fonte primária de produção de superóxido em neutrófilos e macrófagos 9. Phox é um complexo de múltiplas subunidades, cujo conjunto é fortemente regulada 9. O holoenzyme contém várias subunidades reguladoras citosólicas (phox p67, p47 phox, p40 phox e RAC) e uma ligada à membrana heterodímero citocromo b 558 (composto de subunidade CYBA e CYBB). O citocromo b 558 é o núcleo de reacção dentro do qual a subunidade CYBB (também conhecida como p91 e NOX2 phox) realiza a reacção em cadeia redox primário 9. Curiosamente, os seus locais de montagem são diferentes entre os neutrófilos e macrófagos. Em neutrófilos em repouso, citocromo b 558 é mais presente na membrana dos grânulos de armazenamento intracelular 14. Durante a fagocitose, os neutrófilos montar o holoenzymes em phagosomes 9, onde altos níveis de atividade MPO também estão presentes. O neutrófilo Phox consome rapidamente oxigênio e exerce seu poder microbicida pela produção de ROS, um fenômeno denominado explosão respiratória 11. Em contraste, os macrófagos possuem um nível mais baixo de expressão de MPO e citocromo b 558 é encontrado principalmente na membrana de plasma 15, 16. Assim, os neutrófilos produzir altos níveis de superóxido para a actividade anti-microbiana, ao passo que os macrófagos produzem menos superóxido para as funções de regulação 15.

Uma vez que a inflamação é uma intrincada processo in vivo, métodos de imagem não invasivos específicos para as diferentes fases de inflamação permitiria a avaliação quantitativa e longitudinais de modelos de doenças. Utilizando estudos mecanicistas, já anteriormente demonstrado o uso de dois agentes quimioluminescentes, luminol (5-amino-2 ,3-di-hidro-1 ,4-phthalazinedione) e lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato), Para a imagem não-invasivo de fase aguda e tardia (crônica) de inflamação, respectivamente 17. Luminol permite a visualização da actividade de MPO de neutrófilos durante a fase aguda da inflamação, 18-20, ao passo que a bioluminescência lucigenina pode ser usado para avaliar a actividade dos macrófagos, em associação com a fase tardia da inflamação crónica ou 17. Neste manuscrito, foram utilizados dois modelos de inflamação experimentais (sc sc PMA e LPS) para demonstrar as técnicas de imagem.

Protocol

Nota: Todos os estudos com animais foram realizados sob protocolos institucionais aprovados e orientações de cuidados com animais. 1. Reagentes e Soluções Solução PMA sc para inoculação: Prepara-se uma solução de estoque de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), a 5 mg / ml em DMSO. Armazene a solução de reserva, a -20 ° C. Antes da inoculação, descongelar a solução estoque e diluir a 1 mg / ml de PMA, em PBS. Solução de LPS para inocul…

Representative Results

Realizamos imagem de bioluminescência longitudinal para avaliar a inflamação aguda e crônica em modelos experimentais de inflamação. De forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) é um agonista de quinase C da proteína potente (PKC), que activa Phox para a produção de aniões de superóxido e desencadeia respostas inflamatórias agudas intensas 21. SC injeção de 50 mg de PMA na NCR camundongos nude causou irritação rápido da pele e inflamação aguda no local da injeção 18, 22, 23. Realiz…

Discussion

Neste relatório, nós demonstramos um método de bioluminescência de imagem não invasivo da inflamação em animais vivos. Aproveitando os dois substratos luminescentes, o luminol e lucigenina, o método pode distinguir diferentes fases de inflamação. Bioluminescência luminol está associada com neutrófilos na fase aguda da inflamação, enquanto a bioluminescência lucigenina é mediada pelos macrófagos na fase crónica. Relativamente pequenas (PM = 177,16 g / mol) e electricamente carregadas, o luminol pode fa…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nancy Lurie Marks. Agradecemos a Dra. Nancy E. Kohl para a leitura crítica do manuscrito. Agradecemos K. Wong Kin por sua ajuda na preparação deste relatório vídeo.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO P8139  
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO L2012  
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO A4685  
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO M8010  
IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA    

Referenzen

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Tseng, J., Kung, A. L. In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation. J. Vis. Exp. (78), e50690, doi:10.3791/50690 (2013).

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