Summary

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em> Aplysia californica</em> Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

Published: July 10, 2013
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Summary

Se describe la disección del sistema nervioso de la liebre de mar marino<em> Aplysia</em> Después de la anestesia, el aislamiento de las neuronas para el cultivo a corto plazo de los tejidos, y las grabaciones de las corrientes de iones de células individuales a través de la técnica de patch clamp.

Abstract

El molusco gasterópodo marino Aplysia californica tiene una historia venerable como un modelo de funcionamiento del sistema nervioso, con especial importancia en los estudios sobre el aprendizaje y la memoria. Las preparaciones típicas para este tipo de estudios son aquellos en los que la sensorial y motoneuronas se dejan intactos en un animal disecado mínimamente, o neuronal de co-cultivo técnicamente elaborada de sensorial y motoneuronas individual. Menos común es la preparación neuronal aislado en el que pequeños grupos de neuronas nominalmente homogéneos se disocian en células individuales en cultivo a corto plazo. Tales células aisladas son útiles para la caracterización biofísica de las corrientes de iones utilizando técnicas de patch clamp, y la modulación selectiva de estos conductancias. Se describe un protocolo para la preparación de tales cultivos. El protocolo se aprovecha de los fácilmente identificables las neuronas sensoriales de los ganglios de la glutamatérgicas pleural y bucal, y describe su disociación y un mantenimiento mínimo in la cultura durante varios días sin suero.

Introduction

El molusco opistobranch marino Aplysia, ha sido un modelo neurobiológico útil para muchas décadas. Es mejor conocido como modelo de habituación y condicionamiento clásico 7, 8. Los estudios sobre el aprendizaje y la memoria en este modelo ganó el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2000 por Eric R. Kandel, en un premio que compartió con Arvid Carlsson y Paul Greengard 10. Los estudios que implican registros eléctricos a partir de preparaciones reducidas, en la que los elementos del sistema nervioso de este invertebrado se diseccionaron a partir del animal con los nervios y los músculos dejaron adjunta, han ayudado a aclarar los papeles de las neuronas individuales en Aplysia. Identificación de los mecanismos moleculares precisos que constituyen el aprendizaje en Aplysia sin embargo, a menudo empleado otra técnica, a largo plazo co-cultivos de una neurona sensorial y un motoneuronas, obtenido de uno en uno a partir de animales donantes individuales y se dejó formar una sinapsis en la placa de cultivo de 21 .

Nosotros y otros 1, 3, 6, 14, 15, 16 hemos explotado la facilidad con la que identifican las neuronas se pueden orientar en este modelo, así como su resistencia en experimentos a largo plazo para hacer cultivos a corto plazo disociados de grupos de neuronas nominalmente homogéneos en el que se estudian las corrientes iónicas bajo fijación de voltaje en la configuración de patch clamp. Muchas neuronas Aplysia se levantan a las reiteradas rondas de parche de sujeción para dar tiempo a las manipulaciones experimentales de larga duración. La técnica es útil para las neuronas como las células neurosecretoras bolsa del ganglio abdominal, y las neuronas sensoriales de los ganglios pleural y bucal cuya disociación como se describe aquí, pero no para las neuronas muy grandes> 60 m de diámetro, tales como L7 o R2 de el ganglio abdominal. No empleamos suero Aplysia en nuestras culturas, a diferencia de los senso-motoneuronas co-cultivos descritos en otro lugar. La mayoría de las neuronas obtenidas mediante este procedimiento no podrá contar con procesos para tél primero 48 h en cultivo, facilitando toda grabación de voltaje de la célula, pero entonces brotar y elaborar los axones y otros procesos durante aproximadamente 14 días antes de morir a causa de la falta de nutrientes y / o factores de crecimiento.

Esta técnica produce cultivos primarios de neuronas 50-100 por plato de regiones fisiológicamente documentados de los ganglios bucal y pleural. Este protocolo es útil para los investigadores que estudian aspectos de la fisiología de células individuales en experimentos que requieren numerosos experimental repeticiones por animal. Se produce un par coincidente de los cultivos debido a la separación anatómica de las células diana en hemiganglia izquierda y derecha, permitiendo estudios que se benefician del tratamiento combinado y los cultivos de control.

El protocolo se dirige bucales S racimo (BSC), las neuronas del ganglio vestibular, y ventrocaudal (PVC) pleurales neuronas del ganglio pleural. Estas células son de un tamaño apropiado para el conjunto de grabaciones de voltaje de la celda de visualización y Robust respuestas glutamatérgicas. La metodología discutida es apropiado para la mayoría de los ganglios en el sistema nervioso Aplysia.

Protocol

1. Preparación de células En el Día 1, pesar y anestesiar a los animales. Pesar unos 30 g, 1 kg animal. Se anestesia en animales 5-10 volúmenes de agua de mar 01:01: MgCl isotónica. 6H 2 0 durante 1 hora con aireación, tales como una bomba de aire de acuario eléctrico con piedra de aire adjunto. Prepare suministros de disección. Montar la bandeja de disección limpia con alfileres de acero inoxidable, tales como pasadores de tela. Montar varios platos d…

Representative Results

La ubicación de las neuronas sensoriales en los ganglios que están dirigidos en este protocolo, las neuronas BSC y PVC se muestran en la Figura 1. Las neuronas BSC están situados en 2 grupos ovales simétricas en el lado ventral del ganglio vestibular, la superficie que se enfrenta lejos de la masa en el ganglio vestibular intacta (Figura 1A). Las neuronas de PVC forman grupos bilaterales, en forma de V que se envuelven alrededor de la superficie dorsal del ganglio pleural hacia el e…

Discussion

Las técnicas de disociación describen aquí dió cultivos de neuronas sensoriales que contienen 50-100 neuronas aisladas intercalados con pequeños números de células gliales y otras células no identificados. Los pasos más críticos en el protocolo son el tiempo de los ganglios permanecen en solución de enzima, y ​​agitando, la disociación de los grupos de células digeridas para romper el clúster en las células individuales. Digestión enzimática (paso 1.8) debe ser optimizado a la temperatura disponible…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiado por el NIH P40 OD010952, la Fundación Korein, de la Universidad de Miami Fellowship de SLC y una beca de Maytag para ATK. Los autores agradecen al personal de la Nacional de Recursos para la Aplysia, así como Lauren Simonitis y Hannah Peck, quien proporcionó micrografías de una figura.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Artificial seawater ASW Sigma-Aldrich assorted (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution Sigma assorted (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine Sigma P6407  
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 Lonzo Walkersville, Inc. 17-603E 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II Roche Diagnostics 10165859001  
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272  
collagenase type XI Sigma-Aldrich C9407  
L-Glutamate (L-Glu) Sigma-Aldrich 49601-100G  
D-Aspartate (D-Asp) Sigma-Aldrich 11200-10G  
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Biomol 100002-268  
L-Asp Sigma A6683-25G  
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) Sigma A6816-5MG  
L-Glu R antagonists various various  
agar      
kynurenate Sigma-Aldrich 61250  
APV Sigma-Aldrich A5282  
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)      
2-propanol VWRSP BDH1133  
Chloriding solution Sigma assorted 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer World Precision Instruments (WPI) SYL184 Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections Wild    
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator Microoptics of Florida TQ FOI-150  
RotoMix 50800 orbital mixer      
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives SR Research Ltd. Eyelink II  
Tektronix digital oscilloscope SR Research Ltd.    
pClamp 10 data acquisition and analysis software Molecular Devices    
PC with Windows XP or higher operating system PC Solutions   Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller Sutter Instruments, Novato, CA    
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA    
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA CV203BU  
Digidata 1200 A/D converter Molecular Devices, Sunnyvale, CA    
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration Parker Hannifin, Cleveland, OH    
TMC Micro-G Vibration isolation table Ametek    
Faraday cage     custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators Burleigh Instruments; Thorlabs   presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) Narishige USA    
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – WPI 1B150-3  
3 inch length      
Ag/AgCl half cell WPI EP4  
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes VWRSP 21008-918  
Angled Scissors Fine Science Tools 15006-09  
Dumostar Fine forceps Fine Science Tools 11295-00  
35 mm falcon tissue culture dishes VWRSP 25382-064  
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 VWRSP 1013 also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard WPI SYL184  
animal dissection tray various    
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon VWRSP 21008-918 For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends hardware store   For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points) VWRSP   For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 Becton-Dickinson   For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array Narishige USA   For perfusion system
one-way valves     For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl VWRSP   For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)      
Polyethylene tubing Cole Parmer 4.27436E+11  
fine dissection pins Fine Science Tools 26002-20  
capillary tubes Kimble 71900-100   fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay craft store    
dish holder for microscope stage with isolated ground bath     Custom manufacture
pasteur pipettes VWRSP 14672-412  
pipette bulbs VWRSP 53283-911  
acrodisk syringe filters VWRSP 28144-040  
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass WPI 1B150F-3  
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator      

Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

Referenzen

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Fieber, L. A., Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Greer, J. B., Schmale, M. C. Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents. J. Vis. Exp. (77), e50543, doi:10.3791/50543 (2013).

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