Isolamento de neurônios sensoriais de<em> Aplysia californica</em> Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

O molusco opistobranch marinho Aplysia, tem sido um modelo neurobiológico útil para muitas décadas. Ele é mais conhecido como um modelo de habituação e condicionamento clássico ^{7, 8.} Estudos sobre a aprendizagem e memória neste modelo ganhou o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 2000 por Eric R. Kandel, em um prêmio que ele compartilhou com Arvid Carlsson e Paul Greengard ^10. Estudos envolvendo gravações eléctricos de preparações reduzidas, em que os elementos do sistema nervoso deste invertebrado são dissecados do animal com nervos e músculos permanecer ligados, ajudaram a elucidar os papéis de neurónios individuais na Aplysia. A identificação dos mecanismos moleculares precisos que constituem a aprendizagem em Aplysia no entanto, muitas vezes empregue uma outra técnica, a longo prazo co-culturas de um neurónio sensorial e uma neurónios motores, um por um, obtido a partir de animais dadores individuais e deixou-se formar uma sinapse no prato de cultura ²¹ .

Nós e outros ^{1, 3, 6, 14, 15, 16} têm explorado a facilidade com a qual identificou neurônios pode ser alvo neste modelo, bem como a sua resistência em experimentos de longo prazo para fazer culturas de curto prazo dissociadas de aglomerados de neurônios nominalmente homogêneas em que estudamos correntes iônicas sob braçadeira de tensão na configuração de patch clamp. Muitos neurônios Aplysia enfrentar repetidas rodadas de remendo de fixação para dar tempo para manipulações experimentais de longa duração. A técnica é útil para os neurónios tais como as células do saco neurossecretoras do gânglio abdominal, e os neurónios sensoriais do gânglio da pleura e bucal cuja dissociação aqui descrita, mas não no caso de grandes neurónios> 60 um de diâmetro, tal como L7 ou R2 gânglio abdominal. Não empregamos soro Aplysia em nossas culturas, ao contrário dos co-culturas sensório-motoneurônio descritos em outro lugar. A maioria dos neurônios obtidos através deste procedimento será sem processos de tele primeiras 48 h em cultura, facilitando a gravação voltagem da célula inteira, mas, em seguida germinar e elaborar axónios e outros processos para cerca de 14 dias antes da morte da falta de nutrientes e / ou factores de crescimento.

Esta técnica produz culturas primárias de neurônios por 50-100 prato de regiões fisiologicamente documentados do gânglio vestibular e pleural. Este protocolo é útil para pesquisadores que estudam os aspectos da fisiologia da célula única em experimentos que requerem numerosos experimental repetições por animal. Ela produz um par correspondente de culturas devido à separação anatómica das células alvo em hemiganglia esquerda e direita, permitindo estudos que beneficiam com o tratamento combinado e as culturas de controlo.

O protocolo visa bucais S cluster (BSC) neurônios do gânglio vestibular, e ventrocaudais (PVC) neurônios do gânglio pleural pleural. Estas células são um tamanho apropriado para as gravações de tensão de células inteiras e de exibição Robust respostas glutamatérgicos. A metodologia discutido é apropriado para a maioria dos gânglios do sistema nervoso Aplysia.