Isolation des neurones sensoriels de<em> Aplysia californica</em> Patch pour les enregistrements de serrage des courants glutamatergiques

Le mollusque opistobranch marin, l'aplysie, a été un modèle neurobiologique utile pour de nombreuses décennies. Il est surtout connu comme un modèle d'habituation et le conditionnement classique ^{7, 8.} Les études sur l'apprentissage et la mémoire dans ce modèle a remporté le prix Nobel de physiologie ou médecine en 2000 pour Eric R. Kandel, dans un prix qu'il a partagé avec Arvid Carlsson et Paul Greengard ^10. Les études portant sur ​​les enregistrements électriques de réduction des préparations, dans lequel les éléments du système nerveux de cet invertébré sont disséqués à partir de l'animal avec les nerfs et les muscles laissée en place, ont contribué à élucider le rôle des neurones individuels chez l'aplysie. Identification des mécanismes moléculaires précis qui constituent l'apprentissage chez l'aplysie cependant souvent utilisé une autre technique, à long terme des co-cultures d'un neurone sensoriel et un motoneurone, obtenu un par un à partir d'animaux de chaque donateur et a permis de former une synapse à la boîte de culture ²¹ .

Nous et d'autres ^{1, 3, 6, 14, 15, 16} ont exploité la facilité avec laquelle les neurones identifiés peuvent être ciblés dans ce modèle ainsi que leur endurance dans des expériences à long terme pour rendre les cultures à court terme dissociées de groupes de neurones théoriquement homogènes dans lequel nous étudions courants ioniques sous la bride de tension dans la configuration de patch-clamp. Beaucoup de neurones aplysie résistent à des cycles répétés de patch-clamp pour laisser le temps aux manipulations expérimentales de longue durée. La technique est utile pour les neurones, comme les cellules de sac neurosécrétoires du ganglion abdominal, et les neurones sensoriels des ganglions pleural et buccale dont dissociation que nous décrivons ici, mais pas pour les très grands neurones> 60 um de diamètre, comme L7 ou R2 le ganglion abdominal. Nous n'employons pas aplysie sérum dans nos cultures, à la différence des co-cultures sensori-motoneurones décrites ailleurs. La plupart des neurones obtenus en utilisant cette procédure seront sans processus de til 48 premières heures de culture, ce qui facilite l'enregistrement complet de la tension de la cellule, mais sera ensuite germer et élaborer des axones et d'autres processus pour environ 14 jours avant de mourir d'un manque de nutriments et / ou des facteurs de croissance.

Cette technique permet de produire des cultures primaires de neurones 50-100 par boîte de régions physiologiquement documentés des ganglions buccale et pleural. Ce protocole est utile pour les chercheurs qui étudient les aspects de la physiologie de la cellule unique dans les expériences qui nécessitent de nombreuses expérimental reproduit par animal. Il produit une paire assortie des cultures dues à la séparation anatomique des cellules cibles dans hemiganglia gauche et droite, permettant des études qui bénéficient d'un traitement adapté et les cultures témoins.

Le protocole vise buccales S cluster (BSC) des neurones du ganglion buccal et ventrocaudal (PVC) des neurones du ganglion pleural pleurale. Ces cellules sont d'une taille appropriée pour l'ensemble des enregistrements de tension cellulaires et ROBUS d'affichaget réponses glutamatergique. La méthodologie discuté est approprié pour la plupart des ganglions du système nerveux chez l'aplysie.