Summary

Isolamento de neurônios sensoriais de<em> Aplysia californica</em> Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

Published: July 10, 2013
doi:

Summary

Nós descrevemos a dissecação do sistema nervoso do mar marinho lebre<em> Aplysia</em> Após a anestesia, o isolamento de neurônios para a cultura de tecidos de curto prazo e gravações de correntes iônicas única célula através da técnica de patch clamp.

Abstract

O molusco gastrópode marinho Aplysia californica tem uma história venerável como um modelo de funcionamento do sistema nervoso, com particular importância em estudos de aprendizagem e memória. As preparações típicas para esses estudos são aquelas em que o sensorial e motoneurónios são deixadas intactas num animal minimamente dissecados, ou uma técnica elaborada neuronal co-cultura de motoneurónios e sensorial indivíduo. Menos comum é o isolado preparação neuronal em que pequenos grupos de neurônios nominalmente homogêneos são dissociados em células isoladas em cultura de curto prazo. Tais células isoladas são úteis para a caracterização biofísica das correntes de iões utilizando técnicas de patch clamp, e modulação específica destas condutâncias. Um protocolo para a preparação de tais culturas é descrito. O protocolo aproveita os facilmente identificáveis ​​neurônios sensoriais glutamatérgicos do gânglio pleural e bucal, e descreve a sua dissociação e manutenção mínima in cultura durante vários dias, sem soro.

Introduction

O molusco opistobranch marinho Aplysia, tem sido um modelo neurobiológico útil para muitas décadas. Ele é mais conhecido como um modelo de habituação e condicionamento clássico 7, 8. Estudos sobre a aprendizagem e memória neste modelo ganhou o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 2000 por Eric R. Kandel, em um prêmio que ele compartilhou com Arvid Carlsson e Paul Greengard 10. Estudos envolvendo gravações eléctricos de preparações reduzidas, em que os elementos do sistema nervoso deste invertebrado são dissecados do animal com nervos e músculos permanecer ligados, ajudaram a elucidar os papéis de neurónios individuais na Aplysia. A identificação dos mecanismos moleculares precisos que constituem a aprendizagem em Aplysia no entanto, muitas vezes empregue uma outra técnica, a longo prazo co-culturas de um neurónio sensorial e uma neurónios motores, um por um, obtido a partir de animais dadores individuais e deixou-se formar uma sinapse no prato de cultura 21 .

Nós e outros 1, 3, 6, 14, 15, 16 têm explorado a facilidade com a qual identificou neurônios pode ser alvo neste modelo, bem como a sua resistência em experimentos de longo prazo para fazer culturas de curto prazo dissociadas de aglomerados de neurônios nominalmente homogêneas em que estudamos correntes iônicas sob braçadeira de tensão na configuração de patch clamp. Muitos neurônios Aplysia enfrentar repetidas rodadas de remendo de fixação para dar tempo para manipulações experimentais de longa duração. A técnica é útil para os neurónios tais como as células do saco neurossecretoras do gânglio abdominal, e os neurónios sensoriais do gânglio da pleura e bucal cuja dissociação aqui descrita, mas não no caso de grandes neurónios> 60 um de diâmetro, tal como L7 ou R2 gânglio abdominal. Não empregamos soro Aplysia em nossas culturas, ao contrário dos co-culturas sensório-motoneurônio descritos em outro lugar. A maioria dos neurônios obtidos através deste procedimento será sem processos de tele primeiras 48 h em cultura, facilitando a gravação voltagem da célula inteira, mas, em seguida germinar e elaborar axónios e outros processos para cerca de 14 dias antes da morte da falta de nutrientes e / ou factores de crescimento.

Esta técnica produz culturas primárias de neurônios por 50-100 prato de regiões fisiologicamente documentados do gânglio vestibular e pleural. Este protocolo é útil para pesquisadores que estudam os aspectos da fisiologia da célula única em experimentos que requerem numerosos experimental repetições por animal. Ela produz um par correspondente de culturas devido à separação anatómica das células alvo em hemiganglia esquerda e direita, permitindo estudos que beneficiam com o tratamento combinado e as culturas de controlo.

O protocolo visa bucais S cluster (BSC) neurônios do gânglio vestibular, e ventrocaudais (PVC) neurônios do gânglio pleural pleural. Estas células são um tamanho apropriado para as gravações de tensão de células inteiras e de exibição Robust respostas glutamatérgicos. A metodologia discutido é apropriado para a maioria dos gânglios do sistema nervoso Aplysia.

Protocol

1. Preparação celular No dia 1, pesar e anestesiar animal. Pesar a 30 g-1 kg de animal. Anestesiar em 5-10 volumes de animais de 01:01 de água do mar: MgCl isotónica. 6H 2 0 durante 1 hora, com arejamento, tal como uma bomba de ar eléctrica de aquário com uma pedra difusora em anexo. Preparar material de dissecação. Montar bandeja de dissecação limpa com alfinetes de aço inoxidável, tais como pinos de tecido. Montar vários pratos de Petri contendo …

Representative Results

As localizações dos neurónios sensoriais dos gânglios dentro que são orientados neste protocolo, os neurónios do BSC e PVC são mostrados na Figura 1. Os neurónios BSC estão localizados em dois conjuntos ovais simétricos no lado ventral do gânglio vestibular, a superfície que fica virado para fora a partir da massa no gânglio vestibular intacta (Figura 1A). Os neurónios do PVC formam aglomerados bilaterais, em forma de V que envolvem a superfície dorsal do gânglio pleural…

Discussion

As técnicas descritas aqui dissociação produzir culturas de neurônios sensoriais contendo 50-100 neurônios isolados intercaladas com um pequeno número de células gliais e outras células não identificados. Os passos mais críticos na protocolo são o momento em que o gânglio permanecem na solução enzimática, e sacudindo a dissociação dos grupos de células digeridos para quebrar o aglomerado em células individuais. Digestão enzimática (passo 1.8) tem de ser optimizada para a temperatura disponível. A 2…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiado pelo NIH P40 OD010952, a Fundação Korein, da Universidade de Miami Fellowship para SLC e uma bolsa Maytag a ATK. Os autores agradecem o pessoal da Resource Nacional de Aplysia, assim como Lauren Simonitis e Hannah Peck, que forneceu micrografias para a figura.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Artificial seawater ASW Sigma-Aldrich assorted (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution Sigma assorted (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine Sigma P6407  
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 Lonzo Walkersville, Inc. 17-603E 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II Roche Diagnostics 10165859001  
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272  
collagenase type XI Sigma-Aldrich C9407  
L-Glutamate (L-Glu) Sigma-Aldrich 49601-100G  
D-Aspartate (D-Asp) Sigma-Aldrich 11200-10G  
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Biomol 100002-268  
L-Asp Sigma A6683-25G  
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) Sigma A6816-5MG  
L-Glu R antagonists various various  
agar      
kynurenate Sigma-Aldrich 61250  
APV Sigma-Aldrich A5282  
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)      
2-propanol VWRSP BDH1133  
Chloriding solution Sigma assorted 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer World Precision Instruments (WPI) SYL184 Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections Wild    
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator Microoptics of Florida TQ FOI-150  
RotoMix 50800 orbital mixer      
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives SR Research Ltd. Eyelink II  
Tektronix digital oscilloscope SR Research Ltd.    
pClamp 10 data acquisition and analysis software Molecular Devices    
PC with Windows XP or higher operating system PC Solutions   Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller Sutter Instruments, Novato, CA    
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA    
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA CV203BU  
Digidata 1200 A/D converter Molecular Devices, Sunnyvale, CA    
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration Parker Hannifin, Cleveland, OH    
TMC Micro-G Vibration isolation table Ametek    
Faraday cage     custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators Burleigh Instruments; Thorlabs   presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) Narishige USA    
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – WPI 1B150-3  
3 inch length      
Ag/AgCl half cell WPI EP4  
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes VWRSP 21008-918  
Angled Scissors Fine Science Tools 15006-09  
Dumostar Fine forceps Fine Science Tools 11295-00  
35 mm falcon tissue culture dishes VWRSP 25382-064  
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 VWRSP 1013 also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard WPI SYL184  
animal dissection tray various    
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon VWRSP 21008-918 For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends hardware store   For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points) VWRSP   For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 Becton-Dickinson   For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array Narishige USA   For perfusion system
one-way valves     For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl VWRSP   For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)      
Polyethylene tubing Cole Parmer 4.27436E+11  
fine dissection pins Fine Science Tools 26002-20  
capillary tubes Kimble 71900-100   fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay craft store    
dish holder for microscope stage with isolated ground bath     Custom manufacture
pasteur pipettes VWRSP 14672-412  
pipette bulbs VWRSP 53283-911  
acrodisk syringe filters VWRSP 28144-040  
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass WPI 1B150F-3  
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator      

Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

Referenzen

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Fieber, L. A., Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Greer, J. B., Schmale, M. C. Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents. J. Vis. Exp. (77), e50543, doi:10.3791/50543 (2013).

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