Isolering av sensoriske nevroner av<em> Aplysia californica</em> For Patch Clamp Recordings i glutamaterg Currents
Summary
Vi beskriver disseksjon av nervesystemet av det marine sea hare<em> Aplysia</em> Etter anestesi, isolering av nevroner for kortsiktig-vev kultur og innspillinger av encellede ion strøm via patch clamp teknikken.
Abstract
Den marine gastropod mollusk Aplysia californica har en ærverdig historie som en modell av nervesystemet fungerer, med særlig betydning i studier av læring og hukommelse. Den typiske forberedelser for slike studier er de der sensoriske og motoneurons er igjen intakt i en minimal dissekert dyr, eller en teknisk forseggjort neuronal co-kulturen i enkelte sensoriske og motoneurons. Mindre vanlig er det isolerte neuronal forberedelse der små klynger av nominelt homogene nevroner er dissosiert i enkeltceller i kortsiktig kultur. Slike isolerte celler er nyttige for karakterisering av biofysiske ion strømninger ved hjelp av patch clamp-teknikker, og målrettet modulering av slike konduktans. En protokoll for fremstilling av slike kulturer er beskrevet. Protokollen tar nytte av lett identifiserbare glutamatergic sensoriske nevroner av pleural og bukkalt ganglier, og beskriver deres dissosiasjon og minimalt vedlikehold iN kultur i flere dager uten serum.
Introduction
Den marine opistobranch mollusk, Aplysia, har vært et nyttig nevrobiologisk modell for mange tiår. Det er best kjent som en modell for tilvenning og klassisk betinging 7, 8. Studier på læring og hukommelse i denne modellen vant Nobelprisen for fysiologi eller medisin i 2000 for Eric R. Kandel, i en pris han delte med Arvid Carlsson og Paul Greengard 10. Studier med elektriske opptak fra reduserte forberedelser, hvor elementer av nervesystemet av dette virvelløse blir dissekert fra dyret med nerver og muskler igjen festet, har bidratt til å belyse rollene til enkelte nevroner i Aplysia. Identifikasjon av presise molekylære mekanismer som utgjør læring i Aplysia imidlertid ofte brukt en annen teknikk, langsiktige co-kulturer av en sensorisk nervecelle og en motoneuron, innhentet en etter en fra individuelle donordyr og lov til å danne en synapse i kulturen fatet 21 .
Vi og andre 1, 3, 6, 14, 15, har 16 utnyttet den enkle som identifiserte nevroner kan være målrettet i denne modellen, samt utholdenhet deres i langsiktige eksperimenter for å lage dissosiert kortsiktige kulturer av klynger av nominelt homogene nevroner som studerer vi ioniske strømninger under spenning klemmen i patch clamp konfigurasjon. Mange Aplysia nevroner stå opp til gjentatte runder med patch klem å gi tid for langvarige eksperimentelle manipulasjoner. Denne teknikken er nyttig for nerveceller slik som neurosecretory bag celler av buk-ganglion, og de sensoriske nevronene i pleura og buccal ganglier hvis dissosiasjons vi beskrive her, men ikke for meget store neuroner> 60 mikrometer diameter, slik som L7 eller R2 i abdominal ganglion. Vi benytter ikke Aplysia serum i våre kulturer, i motsetning til de sensoriske-motoneuron co-kulturer beskrevet andre steder. De fleste nevroner innhentet ved hjelp av denne prosedyren vil være uten prosesser for than først 48 timer i kultur, tilrettelegging hel celle spenning opptak, men vil da spire og utdype axoner og andre prosesser i ca 14 dager før å dø av mangel på næringsstoffer og / eller vekstfaktorer.
Denne teknikken gir primære kulturer av 50-100 nerveceller per parabol fra fysiologisk dokumenterte regioner av buccale og pleural ganglier. Denne protokollen er nyttig for forskere å studere aspekter ved enkelt celle fysiologi i eksperimenter som krever mange eksperimentelle gjentak per dyr. Den produserer en matchende par av kulturer på grunn av den anatomiske separering av målcellene til venstre og høyre hemiganglia, tillater studier som har nytte av behandling matchet og kontrollkulturer.
Protokollen er rettet mot buccale S cluster (BSC) nevroner av buccale ganglion, og pleural ventrocaudal (PVC) nevroner i pleural ganglion. Disse cellene er en passende størrelse for hele celle spenning opptak og vise Robust glutamatergic svar. Diskutert metodikk er hensiktsmessig for de fleste ganglier i Aplysia nervesystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
De dissosiasjon teknikkene som er beskrevet her gi sensoriske nevroner kulturer som inneholder 50-100 isolerte nerveceller ispedd små mengder gliaceller og andre uidentifiserte celler. De mest kritiske trinnene i protokollen, er den tid ganglia forbli i enzymoppløsning, og bla, dissosiering av de fordøyde celle grupper for å bryte fra hverandre klyngen inn i individuelle celler. Enzym fordøyelse (trinn 1.8) må optimaliseres ved den tilgjengelige temperatur. Ved 23 ° C med langsom risting, er 13 hr tilstrekkelig f…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiert av NIH P40 OD010952, den Korein Foundation, en University of Miami Fellowship til SLC og en Maytag fellesskap å ATK. Forfatterne ønsker å takke de ansatte på National Resource for Aplysia, samt Lauren Simonitis og Hannah Peck, som ga mikrografer for en figur.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
Referenzen
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
- Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
- Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
- Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
- Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
- Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
- Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
- Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
- Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
- Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
- Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
- R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
- Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
- Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
- Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
- Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
- Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
- White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
- Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).
