의 감각 뉴런의 분리<em> 군소 californica</em> 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한
Summary
우리는 해양 바다 토끼 신경계의 해부를 설명<em> 군소</em> 마취 후, 단기 – 조직 문화에 대한 신경과 패치 클램프 기법을 통해 단일 셀 이온 전류의 녹음 격리.
Abstract
해양 복족류 연체 동물 군소 californica는 학습과 기억의 연구에서 특히 의미와 신경계 기능의 모델로 오래된 역사를 가지고 있습니다. 이러한 연구의 일반적인 준비는 감각과의 motoneurons은 최소한의 해부 동물에 그대로 유지 또는 개별 감각과의 motoneurons의 기술적 정교한 신경 세포 공동 배양되는 것입니다. 덜 일반적인 명목상 동종 신경의 작은 클러스터 단기 문화에 하나의 세포로 해리되는 격리 된 신경 세포의 준비입니다. 이러한 고립 된 세포 패치 클램프 기법, 이러한 컨덕턴스의 대상으로 변조를 사용하여 이온 전류의 생물 물리학 적 특성에 유용합니다. 이러한 문화를 준비하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 프로토콜은 흉막과 구강 신경절 쉽게 식별 글루타메이트 감각 뉴런을 활용하고, 그들의 분리와 최소한의 유지 보수를 설명 I혈청없이 며칠 동안 N 문화.
Introduction
해양 opistobranch 연체 동물, 군소은 수십 년 동안 유용하게 신경 생물학 모델이다. 그것은 가장 이니와 고전적 조건 7, 8의 모델로 알려져 있습니다. 이 모델의 학습과 기억에 대한 연구는 그가 Arvid Carlsson의 폴 Greengard 10과 공유 상에 에릭 칸델 Eric R. Kandel을 위해 2000 년에 생리학 또는 의학에 노벨상을 수상했다. 감소 준비에서 전기 녹음과 관련된 연구는, 어떤이 무척추 동물의 신경계의 요소는 신경과 동물에서 해부와 근육이 부착 군소의 개별 뉴런의 역할을 명료 도움이 떠났다. 군소 학습 구성 정확한 분자 메커니즘의 식별하지만, 종종 개별 기증자 동물의 하나 하나를 얻은 또 다른 기술, 장기 감각 신경 세포의 공동 문화와 motoneuron을 고용하고 배양 접시 21 시냅스를 형성 할 수 .
우리는 다른 사람 1, 3, 6, 14, 15, 16 신경이 명목상으로 균일 한 뉴런의 클러스터 해리 단기 문화를 만들기 위해 장기 실험에서뿐만 아니라 자신의 인내로이 모델에서 타겟팅 할 수 있습니다 발견되는 용이성을 악용 한 하는 우리는 패치 클램프 구성에서 전압 클램프에서 이온 전류를 공부합니다. 많은 군소 뉴런은 오랫동안 실험 조작을위한 시간을 허용하는 클램핑 패치의 반복 라운드까지 서있다. 이 기술은 같은 복부 신경절의 neurosecretory 가방 세포와 분리 우리가 설명 흉막 및 구강 신경의 감각 신경으로 신경 유용합니다,하지만 매우 큰 뉴런> 60 μm의 같은 L7으로 직경 또는 R2 복부 신경절. 우리는 다른 설명 감각 – motoneuron 공동 배양과는 달리, 우리의 문화에서 군소 혈청을 사용하지 않습니다. 이 절차를 사용하여 얻은 대부분의 뉴런은 t에 대한 프로세스없이됩니다그는 전체 셀 전압 녹화를 촉진 문화의 첫 48 시간,하지만 그 새싹과 영양분 및 / 또는 성장 인자의 부족으로 사망하기 전에 약 14 일 동안 축삭과 다른 프로세스를 자세히 설명합니다.
이 기술은 구강 및 흉막 신경의 생리적 문서화 지역의 접시 당 50-100 뉴런의 차 문화를 생산하고 있습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 다양한 실험은 동물마다 복제 요구하는 실험에서 단일 세포 생리학의 여러 측면을 연구하는 데 유용합니다. 그것은 일치 처리 및 통제 문화에서 공부하는 혜택을 허용, 왼쪽과 오른쪽 hemiganglia에 표적 세포의 해부학 적 분리에 의한 문화의 일치하는 쌍을 생성합니다.
프로토콜은 구강 신경의 구강 S 클러스터 (BSC) 뉴런, 그리고 흉막 신경절의 흉막 ventrocaudal (PVC) 뉴런을 대상으로합니다. 이러한 세포는 전체 셀 전압 녹음 및 디스플레이 robus에 적절한 사이즈입니다T 글루타메이트 반응. 논의 방법론은 군소 신경계에있는 대부분의 신경에 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
분리 기술은 아교 및 기타 미확인 세포의 작은 숫자와 함께 산재 50-100 고립 된 뉴런을 포함하는 감각 신경 세포의 배양을 얻을 여기에 설명. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 신경 효소 용액에 남아있는 시간이며, 개별 세포로 클러스터를 분열하는 소화 세포 클러스터의 분리를 가볍게 치는. 효소 소화 (단계 1.8) 사용 가능 온도에서 최적화해야합니다. 23 천천히 흔들어 ° C, 13 시간은 BSC 클러스터…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH P40 OD010952, Korein 재단, SLC 마이애미 원정대의 대학과 공격력 MAYTAG 휄로우 십. 저자는 기꺼이 군소뿐만 아니라, 로렌 Simonitis과 그림에 대한 현미경을 제공 한나 펙을위한 국가 자원의 직원을 인정합니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
Referenzen
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