Isolamento dei neuroni sensoriali<em> Aplysia californica</em> Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

Il mollusco opistobranch marino, Aplysia, è stato un modello neurobiologico utile per molti decenni. E 'meglio conosciuto come modello di assuefazione e di condizionamento classico ^{7, 8.} Gli studi sull'apprendimento e la memoria in questo modello ha vinto il premio Nobel per la fisiologia o la medicina nel 2000 per Eric R. Kandel, in un premio che divideva con Arvid Carlsson e Paul Greengard ^10. Gli studi che coinvolgono registrazioni elettriche da preparativi ridotti, in cui gli elementi del sistema nervoso di questo invertebrato sono sezionati dall'animale con nervi e muscoli che si trovino, hanno contribuito a chiarire i ruoli dei singoli neuroni in Aplysia. Identificazione dei meccanismi molecolari precisi che costituiscono l'apprendimento in Aplysia però, spesso utilizzato un'altra tecnica, a lungo termine co-colture di un neurone sensoriale e di un motoneurone, ottenuto uno per uno dai singoli animali donatori e ha permesso di formare una sinapsi nel piatto cultura ²¹ .

Noi e altri ^{1, 3, 6, 14, 15, 16,} abbiamo sfruttato la facilità con cui identificare i neuroni possono essere mirati in questo modello, così come la loro resistenza in esperimenti a lungo termine per rendere le culture a breve termine dissociate di gruppi di neuroni nominalmente omogenee in cui studiarne correnti ioniche sotto voltage clamp nella configurazione di patch clamp. Molti neuroni Aplysia resistono a ripetuti cicli di patch di bloccaggio per consentire il tempo per le manipolazioni sperimentali di lunga durata. La tecnica è utile per i neuroni, come le cellule del sacchetto neurosecretory del ganglio addominale, ei neuroni sensoriali dei gangli pleurico e buccali cui dissociazione descriviamo qui, ma non per molto grandi neuroni> 60 micron di diametro, come L7 o R2 di il ganglio addominale. Noi non utilizziamo Aplysia siero nelle nostre culture, a differenza dei sensori-motoneurone co-culture descritte altrove. La maggior parte dei neuroni ottenuti con questa procedura sono senza processi per tegli prima 48 ore di cultura, facilitando intera registrazione tensione di cella, ma poi germogliare e elaborare assoni e di altri processi per circa 14 giorni prima di morire per mancanza di nutrienti e / o fattori di crescita.

Questa tecnica produce colture primarie di neuroni per 50-100 piatto da regioni fisiologicamente documentate dei gangli buccale e della pleura. Questo protocollo è utile per i ricercatori che studiano gli aspetti della singola fisiologia cellulare in esperimenti che richiedono numerosi sperimentale repliche per animale. Si produce una coppia di culture dovute alla separazione anatomica delle cellule bersaglio in hemiganglia destra e sinistra, permettendo studi che beneficio dal trattamento accoppiati e colture di controllo.

Il protocollo mira buccali S a grappolo (BSC) neuroni del ganglio buccale e pleuriche ventrocaudal (PVC) neuroni del ganglio pleurico. Queste cellule sono in una dimensione appropriata per intere registrazioni di tensione delle cellule e ROBUS visualizzazionet risposte glutamatergiche. La metodologia discusso è appropriato per la maggior gangli del sistema nervoso Aplysia.