का संवेदी न्यूरॉन्स के अलगाव<em> Aplysia californica</em> Glutamatergic धाराओं के पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए
Summary
हम समुद्री समुद्र खरगोश के तंत्रिका तंत्र के विच्छेदन का वर्णन<em> Aplysia</em> संज्ञाहरण के बाद, अल्पावधि-टिशू कल्चर के लिए न्यूरॉन्स, और पैच दबाना तकनीक के माध्यम से एकल कक्ष आयन धाराओं की रिकॉर्डिंग के अलगाव.
Abstract
समुद्री gastropod मोलस्क Aplysia californica सीखने और स्मृति की पढ़ाई में विशेष महत्व के साथ, तंत्रिका तंत्र समारोह की एक मॉडल के रूप में एक आदरणीय इतिहास है. इस तरह के अध्ययन के लिए खास तैयारी संवेदी और motoneurons के एक न्यूनतम विच्छेदित पशु में बरकरार रह, या व्यक्तिगत संवेदी और motoneurons के एक तकनीकी तौर पर विस्तृत न्यूरोनल सह संस्कृति कर रहे हैं जो लोगों में हैं. कम आम नाममात्र सजातीय न्यूरॉन्स के छोटे समूहों अल्पावधि संस्कृति में एकल कक्षों में अलग हैं, जिसमें अलग neuronal तैयारी है. इस तरह अलग कक्षों पैच दबाना तकनीक, और इन conductances की लक्षित मॉडुलन का उपयोग आयन धाराओं के biophysical लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी होते हैं. ऐसी संस्कृतियों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. प्रोटोकॉल फुफ्फुस और मुख गैन्ग्लिया से आसानी से पहचाना glutamatergic संवेदी न्यूरॉन्स का लाभ लेता है, और उनके पृथक्करण और कम से कम रखरखाव का वर्णन मैंसीरम के बिना कई दिनों के लिए n संस्कृति.
Introduction
समुद्री opistobranch मोलस्क, Aplysia, कई दशकों के लिए एक उपयोगी neurobiological मॉडल की गई है. यह सबसे अच्छा आदी होना और शास्त्रीय कंडीशनिंग 7, 8 की एक मॉडल के रूप में जाना जाता है. इस मॉडल में सीखने और स्मृति पर अध्ययन वह Arvid Carlsson और पॉल Greengard 10 के साथ साझा एक पुरस्कार में, एरिक आर कंडेल के लिए 2000 में फिजियोलॉजी या चिकित्सा के लिए नोबेल पुरस्कार जीता. कम तैयारी से इलेक्ट्रिकल रिकॉर्डिंग से जुड़े अध्ययनों से पता चलता है, जिसमें इस अकशेरुकी के तंत्रिका तंत्र के तत्वों नसों के साथ जानवरों से विच्छेदित कर रहे हैं और मांसपेशियों को संलग्न, Aplysia में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की भूमिकाओं को स्पष्ट मदद की है छोड़ दिया है. Aplysia में सीखने का गठन कि सटीक आणविक तंत्र की पहचान हालांकि, अक्सर व्यक्तिगत दाता जानवरों से एक एक करके प्राप्त की एक और तकनीक, लंबे समय तक एक संवेदी न्यूरॉन के सह संस्कृतियों और एक motoneuron, नियोजित और संस्कृति पकवान 21 में एक synapse फार्म की अनुमति दी .
हम और दूसरों के 1, 3, 6, 14, 15, 16 न्यूरॉन्स नाममात्र सजातीय न्यूरॉन्स के समूहों की अलग अल्पावधि संस्कृतियों बनाने के लिए लंबी अवधि के प्रयोगों में के रूप में अच्छी तरह से उनके धीरज इस मॉडल के रूप में लक्षित किया जा सकता है की पहचान की जिस आसानी से शोषण किया है जिसमें हम पैच दबाना विन्यास में वोल्टेज क्लैंप के तहत आयनिक धाराओं का अध्ययन. कई Aplysia न्यूरॉन्स लंबे समय से स्थायी प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए समय की अनुमति clamping पैच के दोहराया राउंड अप करने के लिए खड़े हो जाओ. तकनीक ऐसी पेट नाड़ीग्रन्थि के तंत्रिका बैग कोशिकाओं, और जिसका हदबंदी हम यहाँ वर्णन फुफ्फुस और मुख गैन्ग्लिया का संवेदी न्यूरॉन्स के रूप में न्यूरॉन्स के लिए उपयोगी है, लेकिन नहीं करने के लिए बहुत बड़ी न्यूरॉन्स> 60 माइक्रोन ऐसे L7 के रूप में व्यास, या की आर 2 पेट नाड़ीग्रन्थि. हम कहीं वर्णित संवेदी motoneuron सह संस्कृतियों के विपरीत, हमारे संस्कृतियों में Aplysia सीरम रोजगार नहीं है. इस प्रक्रिया का उपयोग कर प्राप्त अधिकांश न्यूरॉन्स टी के लिए प्रक्रियाओं के बिना किया जाएगावह पूरे सेल वोल्टेज रिकॉर्डिंग की सुविधा संस्कृति में पहले 48 घंटा,, लेकिन फिर अंकुर और पोषक तत्वों और / या वृद्धि कारकों की कमी से मरने से पहले लगभग 14 दिनों के लिए axons और अन्य प्रक्रियाओं की विस्तृत होगा.
इस तकनीक मुख और फुफ्फुस ganglia के physiologically दस्तावेज क्षेत्रों से पकवान प्रति 50-100 न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों पैदा करता है. इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं कई प्रयोगात्मक पशु प्रति replicates की आवश्यकता है कि प्रयोगों में एकल कक्ष शरीर क्रिया विज्ञान के पहलुओं के अध्ययन के लिए उपयोगी है. यह मिलान उपचार और नियंत्रण संस्कृतियों के अध्ययन बताते हैं कि लाभ की अनुमति, बाएँ और दाएँ hemiganglia में लक्ष्य कोशिकाओं के संरचनात्मक जुदाई के कारण संस्कृतियों की एक जोड़ी मिलान पैदा करता है.
प्रोटोकॉल मुख नाड़ीग्रन्थि के मुख एस क्लस्टर (बीएससी) न्यूरॉन्स, और फुफ्फुस नाड़ीग्रन्थि के फुफ्फुस ventrocaudal (पीवीसी) न्यूरॉन्स लक्ष्य. इन कोशिकाओं को पूरे सेल वोल्टेज रिकॉर्डिंग और प्रदर्शन robus के लिए एक उपयुक्त आकार के होते हैंटी glutamatergic प्रतिक्रियाओं. चर्चा की कार्यप्रणाली Aplysia तंत्रिका तंत्र में सबसे गैन्ग्लिया के लिए उपयुक्त है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हदबंदी तकनीक glia और अन्य अज्ञात कोशिकाओं की कम संख्या के साथ interspersed 50-100 पृथक न्यूरॉन्स युक्त संवेदी न्यूरॉन संस्कृतियों उपज यहाँ वर्णित है. प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम गैन्ग्लिया एंजाइम समाधान मे?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच P40 OD010952, Korein फाउंडेशन, एसएलसी को मियामी फैलोशिप के एक विश्वविद्यालय और ATK को एक Maytag फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित है. लेखकों का आभार Aplysia, साथ ही लॉरेन Simonitis और एक व्यक्ति के लिए micrographs प्रदान की जो हन्ना पेक, के लिए राष्ट्रीय संसाधन के कर्मचारियों को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Artificial seawater ASW | Sigma-Aldrich | assorted | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6 |
| Intracellular solution | Sigma | assorted | (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4 |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin |
| Neutral dispase II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| collagenase type XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamate (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartate (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| L-Glu R antagonists | various | various | |
| agar | |||
| kynurenate | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Chloriding solution | Sigma | assorted | 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O |
| Sylgard silicone 2-part polymer | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Provides pin-out surface for small dissection dishes |
| 0-40x zoom magnification microscope for dissections | Wild | ||
| Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator | Microoptics of Florida | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 orbital mixer | |||
| Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Tektronix digital oscilloscope | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 data acquisition and analysis software | Molecular Devices | ||
| PC with Windows XP or higher operating system | PC Solutions | Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors | |
| Flaming/Brown P87 micropipette puller | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D converter | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Vibration isolation table | Ametek | ||
| Faraday cage | custom manufacture | ||
| Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators | Burleigh Instruments; Thorlabs | presently PCS-5000; -6000 series + mounts | |
| Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) | Narishige USA | ||
| Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – | WPI | 1B150-3 | |
| 3 inch length | |||
| Ag/AgCl half cell | WPI | EP4 | |
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes | VWRSP | 21008-918 | |
| Angled Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Dumostar Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm falcon tissue culture dishes | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 | VWRSP | 1013 | also can be made into small dissection dishes with sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| animal dissection tray | various | ||
| 15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | For 6-bore gravity-fed perfusion system |
| Aluminum clips with screw hole ends | hardware store | For perfusion system | |
| 23 gauge needles (manually file off points) | VWRSP | For perfusion system | |
| Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 | Becton-Dickinson | For perfusion system | |
| H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array | Narishige USA | For perfusion system | |
| one-way valves | For perfusion system | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | For perfusion system | |
| 18 gauge needles for suction (filed off points) | |||
| Polyethylene tubing | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| fine dissection pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| capillary tubes | Kimble 71900-100 | fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS | |
| modeling clay | craft store | ||
| dish holder for microscope stage with isolated ground bath | Custom manufacture | ||
| pasteur pipettes | VWRSP | 14672-412 | |
| pipette bulbs | VWRSP | 53283-911 | |
| acrodisk syringe filters | VWRSP | 28144-040 | |
| thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass | WPI | 1B150F-3 | |
| High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator |
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.
Referenzen
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