Summary

Isolation des neurones sensoriels de<em> Aplysia californica</em> Patch pour les enregistrements de serrage des courants glutamatergiques

Published: July 10, 2013
doi:

Summary

Nous décrivons la dissection du système nerveux du lièvre marin mer<em> Aplysie</em> Après anesthésie, l'isolement de neurones pour la culture des tissus court terme, et des enregistrements de courants ioniques de cellules isolées par la technique de patch-clamp.

Abstract

Le mollusque gastéropode marin Aplysia californica a une histoire vénérable comme un modèle de fonctionnement du système nerveux, avec une importance particulière dans les études sur l'apprentissage et la mémoire. Les préparations typiques de ces études sont ceux dans lesquels le sensoriel et motoneurones sont laissées intactes chez un animal très peu disséqué, ou une co-culture neuronale techniquement complexe d'sensorielle individuelle et motoneurones. Moins commun est la préparation neuronale isolée dans laquelle de petits groupes de neurones théoriquement homogènes sont dissociées en cellules isolées en culture à court terme. Ces cellules isolées sont utiles pour la caractérisation biophysique des courants ioniques en utilisant des techniques de patch-clamp, et la modulation ciblée de ces conductances. Un protocole pour la préparation de ces cultures est décrite. Le protocole met à profit les neurones sensoriels glutamatergique facilement identifiables des ganglions pleural et buccale, et décrit leur dissociation et un entretien minimal in culture pendant plusieurs jours sans sérum.

Introduction

Le mollusque opistobranch marin, l'aplysie, a été un modèle neurobiologique utile pour de nombreuses décennies. Il est surtout connu comme un modèle d'habituation et le conditionnement classique 7, 8. Les études sur l'apprentissage et la mémoire dans ce modèle a remporté le prix Nobel de physiologie ou médecine en 2000 pour Eric R. Kandel, dans un prix qu'il a partagé avec Arvid Carlsson et Paul Greengard 10. Les études portant sur ​​les enregistrements électriques de réduction des préparations, dans lequel les éléments du système nerveux de cet invertébré sont disséqués à partir de l'animal avec les nerfs et les muscles laissée en place, ont contribué à élucider le rôle des neurones individuels chez l'aplysie. Identification des mécanismes moléculaires précis qui constituent l'apprentissage chez l'aplysie cependant souvent utilisé une autre technique, à long terme des co-cultures d'un neurone sensoriel et un motoneurone, obtenu un par un à partir d'animaux de chaque donateur et a permis de former une synapse à la boîte de culture 21 .

Nous et d'autres 1, 3, 6, 14, 15, 16 ont exploité la facilité avec laquelle les neurones identifiés peuvent être ciblés dans ce modèle ainsi que leur endurance dans des expériences à long terme pour rendre les cultures à court terme dissociées de groupes de neurones théoriquement homogènes dans lequel nous étudions courants ioniques sous la bride de tension dans la configuration de patch-clamp. Beaucoup de neurones aplysie résistent à des cycles répétés de patch-clamp pour laisser le temps aux manipulations expérimentales de longue durée. La technique est utile pour les neurones, comme les cellules de sac neurosécrétoires du ganglion abdominal, et les neurones sensoriels des ganglions pleural et buccale dont dissociation que nous décrivons ici, mais pas pour les très grands neurones> 60 um de diamètre, comme L7 ou R2 le ganglion abdominal. Nous n'employons pas aplysie sérum dans nos cultures, à la différence des co-cultures sensori-motoneurones décrites ailleurs. La plupart des neurones obtenus en utilisant cette procédure seront sans processus de til 48 premières heures de culture, ce qui facilite l'enregistrement complet de la tension de la cellule, mais sera ensuite germer et élaborer des axones et d'autres processus pour environ 14 jours avant de mourir d'un manque de nutriments et / ou des facteurs de croissance.

Cette technique permet de produire des cultures primaires de neurones 50-100 par boîte de régions physiologiquement documentés des ganglions buccale et pleural. Ce protocole est utile pour les chercheurs qui étudient les aspects de la physiologie de la cellule unique dans les expériences qui nécessitent de nombreuses expérimental reproduit par animal. Il produit une paire assortie des cultures dues à la séparation anatomique des cellules cibles dans hemiganglia gauche et droite, permettant des études qui bénéficient d'un traitement adapté et les cultures témoins.

Le protocole vise buccales S cluster (BSC) des neurones du ganglion buccal et ventrocaudal (PVC) des neurones du ganglion pleural pleurale. Ces cellules sont d'une taille appropriée pour l'ensemble des enregistrements de tension cellulaires et ROBUS d'affichaget réponses glutamatergique. La méthodologie discuté est approprié pour la plupart des ganglions du système nerveux chez l'aplysie.

Protocol

1. Préparation des cellules Le Jour 1, peser et anesthésier des animaux. Peser un g-1 kg animale 30. Anesthésier des volumes d'animaux 5-10 de 1:1 eau de mer: MgCl isotonique. 6H 2 0 pendant 1 h sous aération, comme une pompe à air d'aquarium électrique avec airstone joint. Préparer les fournitures de dissection. Assembler le plateau de dissection propre avec des épingles droites en acier inoxydable, tels que des broches en tissu. Assembler plus…

Representative Results

Les emplacements des neurones sensoriels dans les ganglions qui sont ciblés dans ce protocole, les neurones BSC et PVC sont présentés dans la figure 1. Les neurones BSC sont situés dans deux grappes ovales symétriques sur le côté ventral du ganglion buccal, la surface qui est opposé à la masse dans le ganglion vestibulaire intacte (figure 1A). Les neurones de PVC, forment des grappes en forme de V bilatéraux qui s'enroulent autour de la surface dorsale du ganglion pleural …

Discussion

Les techniques décrites ici dissociation rendement des cultures de neurones sensoriels contenant 50-100 neurones isolés parsemés de petits nombres de cellules gliales et d'autres cellules non identifiés. Les étapes les plus critiques dans le protocole sont les temps les ganglions restent en solution enzymatique, et en tapotant, la dissociation des amas de cellules digérées pour briser la grappe en cellules individuelles. digestion par des enzymes (étape 1.8) doit être optimisée à la température disponibl…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financé par le NIH P40 OD010952, la Fondation Korein, l'Université de Miami Bourse de SLC et une bourse de Maytag à ATK. Les auteurs tiennent à remercier le personnel de la ressource nationale pour l'aplysie, ainsi que Lauren Simonitis et Hannah Peck, qui a fourni microscope pour un chiffre.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Artificial seawater ASW Sigma-Aldrich assorted (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution Sigma assorted (mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine Sigma P6407  
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100 Lonzo Walkersville, Inc. 17-603E 5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II Roche Diagnostics 10165859001  
hyaluronidase Sigma-Aldrich H4272  
collagenase type XI Sigma-Aldrich C9407  
L-Glutamate (L-Glu) Sigma-Aldrich 49601-100G  
D-Aspartate (D-Asp) Sigma-Aldrich 11200-10G  
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Biomol 100002-268  
L-Asp Sigma A6683-25G  
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) Sigma A6816-5MG  
L-Glu R antagonists various various  
agar      
kynurenate Sigma-Aldrich 61250  
APV Sigma-Aldrich A5282  
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)      
2-propanol VWRSP BDH1133  
Chloriding solution Sigma assorted 25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer World Precision Instruments (WPI) SYL184 Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections Wild    
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator Microoptics of Florida TQ FOI-150  
RotoMix 50800 orbital mixer      
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives SR Research Ltd. Eyelink II  
Tektronix digital oscilloscope SR Research Ltd.    
pClamp 10 data acquisition and analysis software Molecular Devices    
PC with Windows XP or higher operating system PC Solutions   Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller Sutter Instruments, Novato, CA    
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA    
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier Molecular Devices, Sunnyvale, CA CV203BU  
Digidata 1200 A/D converter Molecular Devices, Sunnyvale, CA    
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration Parker Hannifin, Cleveland, OH    
TMC Micro-G Vibration isolation table Ametek    
Faraday cage     custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators Burleigh Instruments; Thorlabs   presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer) Narishige USA    
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID – WPI 1B150-3  
3 inch length      
Ag/AgCl half cell WPI EP4  
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes VWRSP 21008-918  
Angled Scissors Fine Science Tools 15006-09  
Dumostar Fine forceps Fine Science Tools 11295-00  
35 mm falcon tissue culture dishes VWRSP 25382-064  
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013 VWRSP 1013 also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard WPI SYL184  
animal dissection tray various    
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon VWRSP 21008-918 For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends hardware store   For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points) VWRSP   For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022″ID x 0.042″OD; 427411 Becton-Dickinson   For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array Narishige USA   For perfusion system
one-way valves     For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl VWRSP   For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)      
Polyethylene tubing Cole Parmer 4.27436E+11  
fine dissection pins Fine Science Tools 26002-20  
capillary tubes Kimble 71900-100   fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay craft store    
dish holder for microscope stage with isolated ground bath     Custom manufacture
pasteur pipettes VWRSP 14672-412  
pipette bulbs VWRSP 53283-911  
acrodisk syringe filters VWRSP 28144-040  
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass WPI 1B150F-3  
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator      

Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.

Referenzen

  1. Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
  2. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia. J. Neurophysiol. 41 (2), 418-431 (1978).
  3. Carlson, S. L., Fieber, L. A. Physiological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. J. Neurophysiol. 106 (4), 1629-1636 (2011).
  4. Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Fieber, L. A. Pharmacological evidence that D-Aspartate activates a current distinct from ionotropic glutamate receptor currents in Aplysia californica. Br. Behav. 2 (4), 391-401 (2012).
  5. Fieber, L. A. Characterization of Na+ and Ca2+ currents in bag cells of sexually immature Aplysia californica. J. Exp. Biol. 201 (5), 745-754 (1998).
  6. Fieber, L. .. A., Carlson, S. L., Capo, T. R., Schmale, M. C. Changes in D-Aspartate ion currents in the Aplysia nervous system with aging. Br. Res. 1343, 28-36 (2010).
  7. Glansman, D. L. Habituation in Aplysia: The Cheshire Cat of neurobiology. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 147-154 (2009).
  8. Hawkins, R. D., Abrams, T. W., Carew, T. J., Kandel, E. R. A Cellular Mechanism of Classical Conditioning in Aplysia: Activity-Dependent Amplification of Presynaptic Facilitation. Science, New. 219 (4583), 400-405 (1983).
  9. Ichinose, M., Sawada, M., Maeno, T., McAdoo, D. J. Effect of acetylcholine on ventrocaudal sensory neurons in the pleural ganglia of Aplysia. Cell Mol. Neurobiol. 9, 233-245 (1989).
  10. Kandel, E. R. . Cellular basis of behavior. , (1976).
  11. Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between nerves and synapses. Science. 294 (5544), 1030-1038 (2001).
  12. Kupfermann, I., Castellucci, V., Pinsker, H., Kandel, E. Neuronal correlates of habituation and habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Science. 167 (3926), 1743-1745 (1970).
  13. Magoski, N. S. Regulation of an Aplysia bag-cell neuron cation channel by closely associated protein kinase A and a protein phosphatase. J. Neurosci. 24 (30), 6833-6841 (2004).
  14. R, E. Neuronal transcriptome of Aplysia: neuronal compartments and circuitry. Cell. 127, 1453-1467 (2006).
  15. Nick, T. A., Kaczmarek, L. K., Carew, T. J. Ionic currents underlying developmental regulation of repetitive firing in Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 16 (23), 7583-7598 (1996).
  16. Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
  17. Tam, A. K., Geiger, J. E., Hung, A. Y., Groten, C. J., Magoski, N. S. Persistent Ca2+ current contributes to a prolonged depolarization in Aplysia bag cell neurons. J. Neurophysiol. 102 (6), 3753-3765 (2009).
  18. Schacher, S., Proshansky, E. Neurite regeneration by Aplysia neurons in dissociated cell culture: modulation by Aplysia hemolymph and the presence of the initial axonal segment. J. Neurosci. 3 (12), 2403-2413 (1983).
  19. Walters, E. T., Byrne, J. H., Carew, T. J., Kandel, E. R. Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J. Neurophysiol. 50 (6), 1522-1542 (1983).
  20. Wilson, G. F., Richardson, F. C., Fisher, T. E., Olivera, B. M., Kaczmarek, L. K. Identification and characterization of a Ca(2+)-sensitive nonspecific cation channel underlying prolonged repetitive firing in Aplysia neurons. J. Neurosci. 16 (11), 3661-3671 (1996).
  21. White, B. H., Nick, T. A., Carew, T. J., Kaczmarek, L. K. Protein kinase C regulates a vesicular class of calcium channels in the bag cell neurons of Aplysia. J. Neurophysiol. 80 (5), 2514-2520 (1998).
  22. Wilson, G. F., Magoski, N. S., Kaczmarek, L. K. Modulation of a calcium-sensitive nonspecific cation channel by closely associated protein kinase and phosphatase activities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95 (18), 10938-10943 (1998).
  23. Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J. Vis. Exp. (28), e1355 (2009).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Fieber, L. A., Carlson, S. L., Kempsell, A. T., Greer, J. B., Schmale, M. C. Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents. J. Vis. Exp. (77), e50543, doi:10.3791/50543 (2013).

View Video