Summary

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

Published: November 14, 2016
doi:

Summary

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Abstract

면역 조직 화학 (IHC)이 높은 특정 안정적이고 매력적인 단백질의 시각화를 제공합니다. IHC 기반의 빛깔 표지의 정확한 성능과 해석은 중추 신경계 (CNS) 등의 지방 함량이 높은 조직에서 목적 단백질 사이의 상호 관계를 평가하기 위해 사용될 때 특히 도전적이다.

우리의 프로토콜은 특히 쥐 CNS와 신경 염증에 의해 영향을받는 주변 림프절 (LN) 모두 구조 및 가용성 단백질의 검출을 위해 조정 된 표준 immunolabeling 기술의 정교화를 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, 추가 수정하거나하지 않고, 우리의 프로토콜 가능성도 여기에 제시된 것보다 다른 기관과 종, 기타 관련 단백질 표적의 탐지를 위해 사용될 수있다.

Introduction

methylome, 사체 또는 프로테옴 수준에서 수행 분석 고급 높은 처리량의 사용에도 불구하고, 면역 염색은 조직 샘플, 세포 배양에 직접 단백질 검출 또는 세포 도말 검사의 황금 표준 남아있다. 지역화 / 배광 패턴을 계시하여 면역 조직 화학 (IHC)의 상대적인 비율과 목표 단백질의 지형적 상호 관계를 평가하고, 그들의 생물학적 활성을 나타낼 수있다. 따라서, IHC 널리 임상 연구 및 진단 목적, 예를 들면, 치료 평가 질병 메커니즘 동물 모델에서 기능적 표현형 변화 등의 연구에 활용

본질적 조직학, 병리학, 생화학 및 면역학을 포함 IHC 크게 형광 표지 된 항체는 감염된 조직 1 폐렴 구균 항원을 식별하기 위해 처음에 사용 된 1941 년 이후로 진행되었다. V휴대 제품과 IHC에 의해 구성 요소의 isualization은 특정 항원은 (Ag)에 대한 항체 (ABS)의 결합을 기반으로합니다. 형광 태그 된 항체를 사용하는 외에, 면역 반응은 2,3- 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제와 같은 효소 (4)을 이용하여 가시화 될 수있다. 방사능 라벨자가 방사선 시각화하는 동안 또한, 콜로이드 금 항체 태그 (5)는 광학 및 전자 현미경 모두에 의해 특정 항원 항체 반응을 검출하기 위해 사용된다.

용 Ag-Ab의의 면역 직접 및 간접적 인 방법을 통해 검출 할 수있다. 직접적인 방법은 직접 차 애비 6 레이블 사용하기 때문에, 본질적으로 빠르고 간단합니다. 그러나, 감도 부족으로 심각한 간접 방법이 직접 사람에게 바람직하다. 두 단계 간접 검출 방법은 상기 제 7 층과 같은 기본 복근 향한 이차 복근 첫번째로, 표지되지 않은 기본 복근 및 표지 필요로한다.신호 증폭을 더 포함함으로써 달성 될 수 있으며, 효소 – 결합 급 순이 (세 단계 간접법) 보조 AB와 결합하는 것이다. 일반적으로 사용되는 간접 검출 방법은 아비딘 – 비오틴과 퍼 옥시 다제 – antiperoxidase (PAP)입니다. 대안 적으로, 알칼리성 포스파타제 antialkaline 포스파타제 (APAAP) 복합체 대신 PAP 방법을 사용할 수있다. 특히, 알칼리성 포스파타제 (AP) 방법은 immunoperoxidase 방법 4보다 더 민감한 것으로 나타납니다. 아비딘 – 비오틴 복합체 (ABC) 방법은 표지 아비딘 – 비오틴 복합체 (LAB) 중 하나와 함께 바이오틴 차 순이를 사용, 또는 스트렙 타비 딘 – 비오틴 복합체 (SLAB) 표지. 검출 감도는 상기 퍼 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제 표지 아비딘 (8)를 포함함으로써 증가 될 수있다. 사용의 다른 검출 방법은 고분자 라벨, 타이 라민 증폭 및 면역 구름 원 9입니다. 특히, 다른 검출 방법은 동일한 조직에 다수의 Ag 검출을 위해 결합 될 수있다여기에 제시된 1978 4. 동시 이중 면역 염색에 처음보고 된 샘플은 각각, 퍼 옥시 다제 – 결합 및 AP 접합 이차 항체를 이용하여 포르말린 고정 된 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 절편에서 수행 하였다. 신호는 각각 (FB) APAAP 복잡한 3,3'- diaminobencidine (DAB) 색 원체 및 패스트 블루를 사용하여 시각화 하였다.

Protocol

윤리 정책 본 연구는 실험 동물에 대한 스웨덴 국립 이사회와 유럽 공동체위원회 지침의 지침에 따라 수행되는 윤리적 허가에 따라 (6백9분의 86 / EEC)는 N338 / 09, N15 / 10 N65 / 10에 의해 승인 된 북한 스톡홀름 동물 윤리위원회. 1. 조직 준비 관류 및 고정 좌심실을 통하여 관류 transcardial 수행 이소 플루 란 동물을 마취. 0.1 M PBS (PFA)에 …

Representative Results

더블 immunostainings (공동의 염색)는 포르말린 고정 파라핀 포함 된 쥐 CNS 및 LN 절에서 수행되었다. 3-5 μm의 두께 조직 슬라이스 사전 코팅 접착 유리 슬라이드에 연속적으로 설치 이전에 10,11,12 설명으로 처리, 썰매 마이크로톰을 사용하여 절단 하였다. 간단히 deparaffinizing, 조직 재수 내생 퍼 옥시 다제 불 활성화 한 후, 절편을 비특이적 결합 부위를 제거하는 단계를…

Discussion

표준 IHC 절차는 종종 일반적으로 폭 넓은 경험뿐만 아니라 "시행 착오"접근 방식을 의미 최적의 결과를 얻기 위해 특정 조정을 필요로한다. 티슈 제조에서 대상 가시화 될 때까지 상기 프로토콜 거의 각 단계는 개별적으로 최종 결과를 개선하기 위해 수정 설계를 실시 할 수있다. 여기에 제시된 이중 염색 프로토콜은 특히 신경 염증에 영향을 포르말린 고정 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 섹…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.

This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Materials

Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) Baxter 1001936060 Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment.
Sodiumchloride (NaCl) Merck 1.0604
Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet Sigma-Aldrich P4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS Apl pharma 34 24 28 Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.
Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich 459844-1L Flamable.
Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich 534056 Flamable. Acute toxicity.
Histo-Comp Paraffin Wax Tissue-Tek V0-5-1001
Adhesive Microscope Slides Starfrost MIC-1040-W
Xylol substitute XEM-200 Vogel GmbH ND-HS-200 Respiratory sensitization. Carcinogenicity.
α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA48G
α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody Millipore MABN92
α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA341R
α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody Santa Cruz BT SC-6181
Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody Dakopatts, Denmark D0314
Biotinylated secondary antibody Amersham Biotech RPN1025
Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-Aldrich A3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) Sigma-Aldrich N4875-1G Acute toxicity.
Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) Sigma-Aldrich FBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) Sigma-Aldrich 31742 Acute toxicity.
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) DAKO S3000 Highly flammable. Toxic.
Copper sulphate (CuSO4) Merck 1.02791 Acute toxicity. Environmental hazzard.
GelTol Aqueous Mounting Medium Thermo Electron Corporation 230100
Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) Merck 107210 Acute toxicity.
Methanol (CH3OH) Fluka 65543 Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.
Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) AppliChem A1379 Skin and eye irritation.
Tris Buffered Saline (TBS), tablet Sigma-Aldrich T5030
Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) Merck 1.0658
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) Merck 1.06346
Fetal calf serum (FCS) Cambrex BioScience DE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKO S3006 Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.
N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) Fluka 40250 Flammable. Acute toxicity.
Glas coverslips 24 x 36 mm Menzel-Gläser BB024036A1
Hydrochloric acid, conc. (HCl) Sigma-Aldrich 30721 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) Fluka 71826 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) Sigma-Aldrich S2252 Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment.
Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) Merck 1.08454 Oral exposures may cause reproductive and developmental effects.
Equipment
Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor Sakura 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome Hacker instruments
Household food steamer Braun MultiGourmet FS 20
Light microscope Leica Polyvar 2

Referenzen

  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. . Introduction to immunocytochemistry. , (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. . Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. . Immunoenzyme multiple staining methods. , (1999).
  26. Elias, J. . Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

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Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Leisser, M., Köck, U., Kury, A., Olsson, T. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. J. Vis. Exp. (117), e50425, doi:10.3791/50425 (2016).

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