Summary

Immunohistochemische analyse in het Rat centrale zenuwstelsel en van perifere lymfeknopen Tissue Secties

Published: November 14, 2016
doi:

Summary

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Abstract

Immunohistochemie (IHC) levert zeer specifiek, betrouwbaar en aantrekkelijk eiwit visualisatie. Correcte uitvoering en interpretatie van een IHC-gebaseerde multicolor etikettering uitdagend, vooral wanneer gebruikt voor het beoordelen van verbanden tussen doeleiwitten in het weefsel met een hoog vetgehalte, zoals het centrale zenuwstelsel (CNS).

Ons protocol is een verfijning van deze techniek immunokleuring bijzonder aangepast voor het detecteren van zowel structurele als oplosbare eiwitten in het rat CNS en perifere lymfeknopen (LN) waarop inflammatoire processen. Niettemin, met of zonder verdere aanpassingen ons protocol kan waarschijnlijk worden gebruikt voor de detectie van gerelateerde targets, zelfs in andere organen en soorten dan hier gepresenteerd.

Introduction

Ondanks het gebruik van geavanceerde high-throughput analyses uitgevoerd op de methyloom, transcriptoom- of zelfs proteoom niveau, immunokleuring blijft de gouden standaard voor eiwit detectie direct in het weefselmonster, celkweek of een cel uitstrijkje. Door de onthulling van de lokalisatie / distributie patroon, kan immunohistochemie (IHC) relatieve verhoudingen en topografische onderlinge relaties van de doeleiwitten te beoordelen, en zelfs geven hun biologische activiteiten. Daarom wordt IHC wijd gebruikt voor klinische en onderzoeksdoeleinden, bijvoorbeeld voor diagnose, behandeling evaluaties studie ziektemechanismen, functionele en fenotypische veranderingen in diermodellen, etc.

Die voornamelijk histologie, pathologie, biochemie en immunologie, heeft IHC aanzienlijke vooruitgang geboekt sinds 1941, toen fluorescent gemerkte antilichamen werden voor het eerst Pneumokokken-antigenen herkennen in het geïnfecteerde weefsel 1. Visualization van cellulaire producten en componenten door IHC is gebaseerd op binding van antilichamen (Ab) niet specifieke antigen (Ag). Naast het gebruik van fluorofoor gelabeld antilichamen kunnen immuunreacties worden gevisualiseerd met behulp van enzymen zoals peroxidase of alkalische fosfatase 2,3 4. Verder colloïdaal goud-tag antilichamen 5 worden gebruikt voor het detecteren van antigeen-antilichaam interactie van licht en elektronenmicroscopie, terwijl radioactieve labels worden gevisualiseerd door autoradiografie.

De Ag-Ab immuunreactie kunnen worden opgespoord via directe en indirecte methoden. De directe werkwijze is in wezen sneller en eenvoudiger, aangezien het direct gebruikt gelabelde primaire Abs 6. Vanwege significant gebrek aan gevoeligheid, indirecte methoden met de directe degenen. Tweestaps indirect detectiemethoden vereisen ongelabeld primaire Abs, als de eerste en gekenmerkt tweede Abs gericht tegen de primaire Abs, de tweede laag 7.Signaalversterking kan gebeuren door met, enzym-gekoppelde tertiaire Ab (drietraps indirecte methode) dat bindt aan de secundaire Ab. Veelgebruikte indirecte detectiewerkwijzen zijn avidine-biotine-peroxidase en antipe- (PAP). Als alternatief kan alkalische fosfatase-antialcalinos fosfatase (APAAP) complex worden gebruikt in plaats van de PAP methode. Met name, alkalische fosfatase (AP) methoden lijken nog gevoeliger dan immunoperoxidase methode 4 zijn. Avidine- biotine complex (ABC) methode gebruikt gebiotinyleerd secundair Ab in combinatie met gemerkte avidine-biotine complex (LAB) of gemerkt streptavidine-biotine complex (SLAB). Detectiegevoeligheid kan verder worden vergroot door met avidine gemerkt met peroxidase of alkalische fosfatase 8. Andere opsporingsmethoden in gebruik zijn polymere etikettering, tyramine versterking en immuno-rolling circle 9. Met name kunnen verschillende detectiemethoden worden gecombineerd voor meerdere Ag detectie in hetzelfde weefselmonster, die in 1978 4. Simultaan dubbele immunokleuring hier gepresenteerd voor het eerst werd gemeld werd uitgevoerd in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde rat CNS en LN weefselcoupes met behulp van peroxidase-gebonden en AP-geconjugeerde secundaire antilichamen, respectievelijk. De signalen werden zichtbaar gemaakt met 3,3'-diaminobenzidine (DAB) chromogeen en de Fast Blue (FB) APAAP complex, respectievelijk.

Protocol

ethische verklaring Deze studie wordt uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Zweedse Nationale Raad voor proefdieren en de Europese Richtlijn Gemeenschapsraad (86/609 / EEG van de Raad) in het kader van de ethische vergunningen N338 / 09, N15 / 10 en N65 / 10, die werden goedgekeurd door de North Stockholm Animal Ethics Committee. 1. Tissue Voorbereiding Perfusie & fixatie Verdoven het dier met isofluraan om tr…

Representative Results

Dubbele immunokleuring (co-kleuringen) werden in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde rat CNS en LN secties. 3-5 micrometer dikke weefsel plakjes werden gesneden met behulp van een slee microtoom, gemonteerd vervolgens op pre-coated lijm glasplaatjes en behandeld zoals eerder beschreven 10,11,12. Kort na deparaffiniseren, weefsel rehydratie en endogene peroxidase inactivering werden secties onderworpen aan het antigeen ophaalproves, gevolgd door een blokkerende stap as…

Discussion

IHC standaard procedures vereisen vaak specifieke aanpassingen van een optimaal resultaat, dat gewoonlijk inhoudt ruime ervaring maar ook "trial and error" benadering te verkrijgen. Uit weefsel preparaat tot doel visualisatie kan bijna elke stap in het protocol onderworpen individueel ontwerp modificaties om het uiteindelijke resultaat te verbeteren. Dubbele kleuring protocol hier gepresenteerde voorbeeld IHC-eiwitten richt bijzonder aangepast voor het beoordelen onderlinge relaties tussen de eiwitten van het …

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.

This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Materials

Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) Baxter 1001936060 Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment.
Sodiumchloride (NaCl) Merck 1.0604
Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet Sigma-Aldrich P4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS Apl pharma 34 24 28 Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.
Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich 459844-1L Flamable.
Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich 534056 Flamable. Acute toxicity.
Histo-Comp Paraffin Wax Tissue-Tek V0-5-1001
Adhesive Microscope Slides Starfrost MIC-1040-W
Xylol substitute XEM-200 Vogel GmbH ND-HS-200 Respiratory sensitization. Carcinogenicity.
α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA48G
α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody Millipore MABN92
α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA341R
α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody Santa Cruz BT SC-6181
Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody Dakopatts, Denmark D0314
Biotinylated secondary antibody Amersham Biotech RPN1025
Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-Aldrich A3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) Sigma-Aldrich N4875-1G Acute toxicity.
Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) Sigma-Aldrich FBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) Sigma-Aldrich 31742 Acute toxicity.
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) DAKO S3000 Highly flammable. Toxic.
Copper sulphate (CuSO4) Merck 1.02791 Acute toxicity. Environmental hazzard.
GelTol Aqueous Mounting Medium Thermo Electron Corporation 230100
Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) Merck 107210 Acute toxicity.
Methanol (CH3OH) Fluka 65543 Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.
Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) AppliChem A1379 Skin and eye irritation.
Tris Buffered Saline (TBS), tablet Sigma-Aldrich T5030
Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) Merck 1.0658
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) Merck 1.06346
Fetal calf serum (FCS) Cambrex BioScience DE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKO S3006 Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.
N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) Fluka 40250 Flammable. Acute toxicity.
Glas coverslips 24 x 36 mm Menzel-Gläser BB024036A1
Hydrochloric acid, conc. (HCl) Sigma-Aldrich 30721 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) Fluka 71826 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) Sigma-Aldrich S2252 Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment.
Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) Merck 1.08454 Oral exposures may cause reproductive and developmental effects.
Equipment
Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor Sakura 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome Hacker instruments
Household food steamer Braun MultiGourmet FS 20
Light microscope Leica Polyvar 2

Referenzen

  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. . Introduction to immunocytochemistry. , (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. . Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. . Immunoenzyme multiple staining methods. , (1999).
  26. Elias, J. . Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Leisser, M., Köck, U., Kury, A., Olsson, T. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. J. Vis. Exp. (117), e50425, doi:10.3791/50425 (2016).

View Video