Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren
Summary
Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.
Abstract
Aanzienlijke inspanningen werden verzameld om grootschalige uitgebreide eiwit-eiwit interactie netwerk kaarten te genereren. Dit is een randvoorwaarde om de pathogeen-gastheer relaties begrijpen en werd hoofdzakelijk uitgevoerd door genetische screenings in gist twee-hybride systemen. De recente verbetering van eiwit-eiwit interacties detectie door een Gaussia luciferase-gebaseerde fragment complementatie test biedt nu de mogelijkheid om integratieve vergelijkende interactomic benaderingen nodig ontwikkelen om rigoureus interactieprofielen van eiwitten te vergelijken van verschillende pathogene stam varianten tegen een gemeenschappelijke set van cellulaire factoren.
Dit document richt zich specifiek op het nut van het combineren van twee orthogonale methoden om eiwit-eiwit interactie datasets te genereren: gist twee-hybride (Y2H) en een nieuwe test, high-throughput Gaussia princeps eiwit complementeringsbepaling (HT-GPCA) uitgevoerd in zoogdiercellen.
nt '> Een grootschalige identificatie van cellulaire partners van een pathogeen eiwit wordt uitgevoerd door voortplanting gebaseerd gist twee-hybride screening van cDNA-bibliotheken die meerdere pathogenen stamvarianten. Een subgroep van interactie partners geselecteerd op een veel vertrouwen statistische scoring verder gevalideerd in zoogdiercellen paarsgewijze interacties met het geheel van pathogene varianten eiwitten met HT-GPCA. Deze combinatie van twee complementaire methoden verbetert de robuustheid van de interactie dataset, en kan de prestatie van een strenge vergelijkende interactieanalyse. die vergelijking interactomics vormen een betrouwbare en krachtige strategie te ontcijferen elke pathogeen-gastheer wisselwerkingen.Introduction
De toenemende hoeveelheid gegevens verzameld om eiwit-eiwit interacties kaarten genereren opent perspectieven om verder te begrijpen pathogeen infecties. Als globale begrip van pathogeen infecties begint te ontstaan, het biedt toegang tot het bereik van de verstoringen veroorzaakt door ziekteverwekkers eiwitten bij het aansluiten van het menselijk proteoom 1. Het biedt daarmee een manier om te begrijpen hoe pathogenen manipuleren van de gastheercel machinerie. Met name de afbeelding van verscheidene virale en gastheer interactienetwerken gebleken dat virale eiwitten voorkeur samen eiwitten die sterk verbonden in het cellulaire netwerk (hubs), of die essentieel zijn voor vele paden in een netwerk (bottlenecks eiwitten) 2-4 targeten. Deze interacties kunnen virussen op belangrijke cellulaire processen te manipuleren, dat is instrumenteel om te repliceren en te produceren infectieus nageslacht. Vergelijkende interacties mapping werden onlangs uitgevoerd op verwante virussen met het doel om informatie met betrekking totpathogenese 4. Bovendien hebben studies van de gastheer-pathogenen interacties landschap uitgebreid naar vele ziekteverwekkers 5. De gerichte cel identificatie factoren geeft inzicht in de strategieën die door ziekteverwekkers om cellen te infecteren en maakt de ontdekking van potentiële pathogene markers.
De gist twee-hybride systeem is de meest populaire methode om binaire interacties vast omdat genetische screening is een efficiënt en gevoelig hulpmiddel voor high-throughput kaart brengen van eiwit-eiwit interacties. De hier voorgestelde aanpak verbetert verder individuele Y2H screenings door beoordeling van een eiwit van meerdere pathogenen stamvarianten, waardoor toegang tot een vergelijkend overzicht van pathogeen-gastheer eiwit-eiwit interacties. Bovendien is een belangrijke beperking van gist twee-hybride screening ligt in een hoog percentage vals-negatieve, aangezien herstelt ongeveer 20% van de totale interacties 6. Dit betekent dat interactie gedetecteerd met slechts een subset van pathogens varianten zouden zijn ontsnapt detectie met de anderen. Daarom worden de individuele partners die uit alle twee-hybride screening verder uitgedaagd voor interactie met het complete assortiment van stammen bestudeerd, verstrekking van vergelijkende interactie datasets. Aangezien werd aangetoond dat het combineren van verschillende methodologieën sterk verhoogt de robuustheid van eiwit-eiwit interacties datasets 7, wordt deze validatie uitgevoerd in zoogdiercellen door een nieuw ontwikkelde eiwit fragment complementatie bepaling genoemd HT-GPCA 8. Deze cel-gebaseerde systeem kan de detectie van eiwit interacties door complementatie van de Gaussia princeps gesplitst luciferase en is ontworpen compatibel met een hoog-formaat zijn. Dankzij de luminescentie gebaseerde technologie en lage achtergrondruis in vergelijking met andere fluorescentie-gebaseerde test, HT-GPCA toont een opvallend hoge gevoeligheid.
Kortom, deze benadering vormt een efficiëntehulpmiddel om een uitgebreide kaart brengen van gastheer-pathogeen wisselwerkingen, die de eerste stap naar een wereldwijd begrip van de gastheercel kapen vertegenwoordigt genereren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Onafhankelijk, gist-twee hybride en zoogdieren interactie assays, zoals GST pull-down, LUMIER of MAPPIT, hebben bewezen effectieve tools om eiwit-eiwit interacties te detecteren, maar worden beperkt door het hoge percentage van vals-positieve en vals-negatieve interacties die met deze technieken 15. Bovendien is bewijs groeit dat combineren orthogonale methoden verhoogt de betrouwbaarheid van de verkregen interactie dataset 7. De recente ontwikkeling van de HT-GPCA hier beschreven techniek is niet …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door de financiering van het Institut Pasteur en door subsidies van de Ligue nationale contre le Cancer (subsidies R05/75-129 en RS07/75-75), de Association pour la Recherche sur le Cancer (subsidies ARC A09 / 1/5031 en 4867), en het Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 en ANR09 MIEN 026 01). MM was een ontvanger van een MENRT fellowship.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
Referenzen
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
- de Chassey, B., et al. Hepatitis C virus infection protein network. Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).
- Simonis, N., et al. Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses. Retrovirology. 9, 26 (2012).
- Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens. PLoS Pathog. 4, e32 (2008).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437, 1173-1178 (2005).
- Venkatesan, K., et al. An empirical framework for binary interactome mapping. Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).
- Cassonnet, P., et al. Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes. Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).
- Ito, T., et al. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).
- Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization. Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Muller, M., et al. Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions. PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).
- Neveu, G., et al. Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase. Methods. , (2012).
- Braun, P., et al. An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions. Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).
