Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren
Summary
Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.
Abstract
Erhebliche Anstrengungen wurden versammelt, um groß angelegte umfassende Protein-Protein-Interaktion Netzwerk Karten zu erzeugen. Dies ist maßgeblich auf die Erreger-Wirt-Beziehungen verstehen und wurde im Wesentlichen durch genetische Screenings in Hefe-Zwei-Hybrid-Systemen durchgeführt. Die jüngste Verbesserung der Protein-Protein-Wechselwirkung Erfassung durch einen Gaussia Luciferase-basierte Fragment Komplementierung Assay bietet nun die Möglichkeit, integrative Ansätze notwendig vergleichende interactomic entwickeln konsequent vergleichen Interaktion Profile von Proteinen aus verschiedenen Erreger Stammvarianten gegen einen gemeinsamen Satz von zellulären Faktoren.
Dieses Dokument konzentriert sich insbesondere auf die Nützlichkeit der Kombination von zwei orthogonalen Methoden zur Protein-Protein-Wechselwirkung Datensätzen zu generieren: Hefe Zwei-Hybrid (Y2H) und eine neue Assays mit hohem Durchsatz Gaussia princeps Protein Komplementations-Assay (HT-GPCA) in Säugetierzellen durchgeführt.
nt "> Eine groß angelegte Identifizierung zellulärer Partner eines Erregers Protein wird durch Kreuzen-basierten Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings von cDNA-Bibliotheken mit mehreren Erreger Stammvarianten durchgeführt. Eine Teilmenge der interagierenden Partner auf einem High-Vertrauen statistischen Scoring ausgewählt ist weiter validiert in Säugerzellen für paarweisen Interaktionen mit dem ganze Reihe von Varianten Erreger Proteine mit HT-GPCA. Diese Kombination aus zwei komplementären Methoden verbessert die Robustheit der Interaktion Datenmenge und ermöglicht die Durchführung einer strengen vergleichende Analyse Interaktion. Solche vergleichende Interactomics bilden eine zuverlässige und leistungsstarke Strategie zu entziffern irgendwelche Erreger-Wirt-Wechselspiel.Introduction
Die zunehmende Menge an Daten gesammelt, um Protein-Protein-Wechselwirkung Karten erzeugen öffnet Perspektiven weiter zu verstehen Erreger Infektionen. Als globales Verständnis von pathogenen Infektionen beginnt sich abzuzeichnen, bietet es Zugriff auf den Bereich von Störungen durch Erreger Proteine induziert beim Anschließen des menschlichen Proteoms 1. Es bietet damit einen Weg zu verstehen, wie Krankheitserreger die Wirtszelle Maschinen manipulieren. Insbesondere ergab die Zuordnung von mehreren viralen-Wirt-Interaktion Netzwerke dass virale Proteine bevorzugt Zielrechner Proteine, die stark in das Mobilfunknetz angeschlossen sind (Hubs), oder die von zentraler Bedeutung für viele Pfade in einem Netzwerk (Engpässe Proteine) 2-4 sind. Diese Wechselwirkungen können Viren auf wichtige zelluläre Prozesse zu manipulieren, was instrumental zu replizieren und infektiöse Nachkommen. Vergleichende Wechselwirkungen Mapping wurden kürzlich auf verwandten Viren mit dem Ziel, Informationen bezüglich extrahieren durchgeführtPathogenese 4. Darüber hinaus haben Studien der Wirt-Erreger-Interaktionen Landschaft zu viele Krankheitserreger 5 erweitert. Die gezielte Zellfaktoren Identifizierung bietet Einblicke in die Strategien, die von Pathogenen verwendet, um Zellen zu infizieren und ermöglicht den Nachweis von pathogenen Potential Marker.
Die Hefe-Zwei-Hybrid-System ist die beliebteste Methode, um binäre Interaktionen zu identifizieren, da genetisches Screening ist eine effiziente und empfindliches Werkzeug für High-Throughput-Mapping von Protein-Protein-Interaktionen. Der hier vorgeschlagene Ansatz weiter verbessert einzelnen Y2H Screenings durch die Beurteilung ein Protein aus mehreren Krankheitserregern Stammvarianten, um so den Zugang zu einem vergleichenden Überblick über Pathogen-Wirt-Protein-Protein-Interaktionen. Darüber hinaus liegt eine große Einschränkung der Hefe-Zwei-Hybrid-Screening in einem hohen falsch-negative Rate, da sie etwa 20% der gesamten Wechselwirkungen 6 erholt. Dies bedeutet, dass Interaktionen mit nur einer Teilmenge von patho erkanntgens Varianten könnten Erkennung mit den anderen entgangen sein. Daher werden die einzelnen Partner, die aus allen Zwei-Hybrid-Screenings weiter für die Interaktion mit dem kompletten Sortiment der untersuchten Stämme herausgefordert, vergleichende Interaktion Datensätzen. Da wurde gezeigt, dass die Kombination verschiedener Methoden stark erhöht die Robustheit von Protein-Protein-Wechselwirkung Datensätze 7 wird diese Validierung in Säugetierzellen durch ein neu entwickeltes Protein-Fragment Komplementierung Assay genannt HT-GPCA 8 durchgeführt. Diese Zell-basierte System ermöglicht die Detektion von Protein-Interaktionen durch Komplementierung des Gaussia princeps aufgeteilt Luciferase und wurde entwickelt, um die Kompatibilität mit einem Hochdurchsatz-Format. Dank seiner Lumineszenz-basierten Technologie und deren geringem Hintergrundrauschen mit anderen Fluoreszenz-basierten Assay verglichen, zeigt HT-GPCA eine auffallend hohe Empfindlichkeit.
Insgesamt stellt dieser Ansatz eine effizienteWerkzeug, um eine umfassende Kartierung von Wirt-Pathogen-Zwischenspiele, die den ersten Schritt in Richtung einer globalen Verständnis der Wirtszelle Entführung repräsentiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unabhängig, Hefe-Zwei-Hybrid-und Säugetierzellen Interaktionsassays wie GST-Pulldown, LUMIER oder Mappit, haben sich als effektive Werkzeuge, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen sein, aber durch die hohe Rate der falsch-positiven und falsch-negativen beschränkt Wechselwirkungen mit diesen Techniken 15 verbunden. Darüber hinaus ist Beweis wächst, dass die Kombination von orthogonal Verfahren erhöht die Zuverlässigkeit der erhaltenen Wechselwirkung Datensatz 7. Die jüngste Entwick…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Mittel aus dem Institut Pasteur und durch Zuschüsse aus dem Ligue nationale contre le Cancer (Zuschüsse R05/75-129 und RS07/75-75), der Vereinigung pour la Recherche sur le Cancer (Zuschüsse ARC A09 / unterstützt 1/5031 und 4867) und die Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 und 026 01 ANR09 MIEN). MM war ein Empfänger einer MENRT Gemeinschaft.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast strains | Clontech | ||
| Minimal SD base | US biological | D9500 | |
| Amino acids | Sigma | ||
| 3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1810 | |
| Phosphate buffer Saline (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferase assay | Promega | E2820 | |
| White culture plate | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-wellPCR plates | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubator (30 °C) | Memmert | ||
| Incubator (37 °C) | Heraeus | ||
| Luminometer | Berthold | Centro XS-LB 960 |
Referenzen
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