Laser Capture mikrodissektion av berikade populationer av nervceller eller Single neuroner för genuttrycksanalys efter traumatisk hjärnskada

Genuttrycksanalys av heterogena vävnader har alltid varit problematiskt,. Detta gäller särskilt i däggdjurshjärnan, som har cirka 5.000 olika celltyper ⁴ Före utvecklingen av lasern fånga mikrodissektion (LCM) teknik, genomiska studier av effekterna av TBI in vivo var baserade på analys av genuttryck i en blandad population av hjärnan består celler, inte bara av olika neuronala celltyper, men också att stödja gliaceller och immunmodulerande celler. De resulterande komplexa genuttryck profiler som erhållits från dessa heterogena vävnader, och de ofta motstridiga mönster av skador-inducerade cellulära signaler, kan vara en förklaring till misslyckandet i humana kliniska prövningar av terapeutiska strategier visat sig effektiv i prekliniska studier av TBI. ⁵

För att få en tydlig förståelse av skada-inducerad genuttryck i utsatta populationer av nervceller från råtta höftenpocampus antog vi tekniken av LCM, först rapporterades av Emmert-Buck et al. ³ Därefter vi ändrade och optimerade denna mikrodissektion teknik för effektiv insamling av berikade populationer av nervceller och enskilda neuroner för mRNA-profilering med kvantitativ realtids PCR och microarray analys . För att bibehålla integriteten hos mRNA i frusna sektioner av hjärnvävnad för genomisk analys, modifierade vi befintliga protokoll för fixering, färgning och snabb infångning av neuroner från frysta sektioner råtthjärna. För identifiering och isolering av skadade och döende hippocampus nervceller, optimerat vi också fluor-Jade färgning teknik för LCM. Fluor-Jade skiljer inte mellan apoptotisk och nekrotisk celldöd. Sålunda, kan alla typer av degenererande neuroner kan detekteras genom denna fläck. ^6,7

Här beskriver vi det protokoll som används i vårt laboratorium för att få pooler av enstaka döende eller efterlevande neuroner samt stråk av anrikad populations av distinkta neuronala celltyper (dvs. CA1-CA3 neuroner för genuttrycksanalys efter TBI). Förfarandet för flytande slagverk hjärnskada utförs i vårt laboratorium beskrivs i detalj i Shimamura et al. ⁸ och är mycket lik den laterala fluid slagverk skada protokoll för möss publicerade i JUPITER av Alder et al. Eftersom LCM tekniken har ⁹ visats ha minimal eller ingen effekt på integriteten av DNA, RNA och protein i vävnader, är detta ett utmärkt verktyg för molekylär och proteinanalys av definierade celltyper.

1. Kirurgiska ingrepp och Fluid slagverk TBI

1. Samtliga djurförsök först godkännas av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas och National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur (8: e upplagan, National Research Council).
2. Råttor (vuxna Sprague-Dawley-råttor, 400-500 g erhölls från säljaren Charles Rivers, Portland, Maine) inhyses två per bur och tillhandahålls mat och vatten ad libitum i ett vivarium med dessa konstanta betingelser: ljuscykel (600 h till 1.800 h), temperatur (21 ° C till 23 ° C) och fuktighet (40% till 50%) en vecka före användning.
3. Söva råttor med 4% isofluran, intubera och mekaniskt ventilera (Nemi Scientific, New England Medical Instruments, Medway, MA) råttorna med 1,5-2,0% isofluran i syre: luft (70:30) och förbereda dem för parasagittal vätske-slagverk skada såsom tidigare beskrivits. ⁸, 10
4. Offra råttor vid lämplig tidpunkt efter skada beroende på experimentell design. Snabbt bort hjärnor, frysa omedelbart på torris och förvara vid -80 ° C i ett 50 ml rör eller gå direkt att bädda in oktober för fryst snittning.

2. Snittning och Färgning av råtthjärna

1. Hjärnvävnad som inte används omedelbart kan förvaras vid -80 ° C i upp till en månad om den förvaras i en konstant temperatur. Hjärnor som fryses vid -80 ° C, tinades därefter till -20 ° C för sektionering, och sedan frysas inte ger kvalitet RNA efter den andra upptining. När hjärnan tinas, monterad i OCT och snittades, bör objektglasen färgas inom 24 h och används för LCM inom 30 minuter till en timme av färgning. Detta kommer att säkerställa god kvalitet RNA. Efter LCM kan infångade celler på LCM lock lagras i lyseringsbuffert vid -80 ° C i upp till en vecka, men RNA bör isoleras i tid för att säkerställa högsta kvalitet. </ Li>
2. Innan sektionering hjärnan, torka av kryostaten med RNas-Zap och rengör borstarna med EtOH (byt den disponibla bladet mellan varje hjärna).
3. Hämta hjärnan i 50 ml rör från -80 ° C frys, placera den i kryostaten vid en temperatur av -22 ° C och upptining i röret under ca 10 minuter. Avlägsna hjärna från röret och placera på scenen på gasväv, ventrala sidan uppåt.
4. Användning av ett rakblad, skiva hjärnan att avlägsna den bakre delen av hjärnan bara rostralt om lillhjärnan och den främre delen vid den optiska chiasm. Fyll en cryomold med oktober monteringsmedium (Tissue Tek) och placera hjärnan i formen med den främre sidan nedåt. Låt hjärnvävnaden att frysa i monteringsmedium tills den blir vit (ungefär 10 minuter).
5. Frys provet skivan (Tissue Tek) på hjärnan med oktober Avlägsna hjärna från formen. Sätt hjärnan i preparathuvudet och dra åt skruvarna.
6. Sätt i ett disposaBLE, låg profil blad (Fisher Scientific) i knivhållaren och dra spaken nedåt.
7. Börja skivning hjärnan vid 20 um för att avlägsna det yttre skiktet av oktober När hippocampus regionen nås ställer mikron ratten 10. Samla koronala seriesnitt genom att placera ett objektglas eller plus-glasskiva på vävnadssnittet (Fisher Scientific). Objektglasen bevaras vid -20 ° C i en RNas-fri färgning rack tills snittning är klar.
8. För att ta bort alla RNaser från glas där vävnadssnitt behandlas, torka ner alla fläckar behållare och graderade cylindrar med Eliminase (Fisher Scientific) och skölj i Milli Q-vatten. Bered alla lösningar med RNas-fritt vatten och filtrera kresylviolett (Sigma-Aldrich) och fluor-Jade (Histo-chem) fläck med ett 0,2 ^ m filter före användning.
9. Tina hjärnsektioner vid RT under 30 sek och fixera i 75% EtOH (1 minut).
10. För LCM av enstaka skadade nervceller efter fixering, skölj objektglasen i RNas-fritt vatten (1 min), Motfärga med 1% kresylviolett (15-20 sek), skölj i RNas-fritt vatten (2 x 30 sek), fläck med fluoro-Jade (4 min), skölj i RNas-fritt vatten (3 x 1 min), dehydratisera med 95% ETOH tillverkad av RNas-fritt vatten (30 sek), 100% EtOH (30 sek), och xylen (2 x 3 min).
11. För LCM av stråk av nervceller efter fixering, skölj objektglasen i RNas-fritt vatten (1 min), fläcken med 1% kresylviolett (1 min), skölj i RNas-fritt vatten för (3 × 1 min), torkar med 95% EtOH (2 x 30 sek), 100% EtOH (2 x 30 sekunder), och xylen (2 x 3 min).
12. Lufttorka alla sektioner i ett dragskåp under 15 min före LCM. Objektglas kan förvaras, avsnitt sidor upp, i ett bildspel låda fodrad med torkmedel, om de behöver flyttas från rum till rum. Emellertid optimala resultat erhålls om LCM utförs omedelbart efter sektioner är torra. LCM bör begränsas från 30 minuter till 1 timme. I nästa avsnitt beskriver vi först hur man fångar kontinuerliga stråk av celler, som är easiest att behärska för dem som lär denna teknik. Sedan beskriver vi hur exakt för att fånga enstaka nervceller. I vår procedur identifierar vi döende nervceller genom sin affinitet för fluor-Jade-en markör för degenererande neuroner. Fluor-Jade-negativa celler antas vara överlevande nervceller.

3. Laser Capture mikrodissektion (LCM)

LCM av stråk av berikade populationer av hippocampus neuroner

1. LCM utförs med användning av en PixCell lie mikroskop med en infraröd diodlaser (Life Technologies).
2. Justera mitten joysticken till vertikalt läge. Vrid och lås 4X mål på plats.
3. Placera en bild i mitten av mikroskopets objektbord och manuellt justera tills regionen av hippocampus är i sikte. Använd grova och fina fokus justeringar för att få bilden i fokus.
4. Aktivera vakuumchuck genom att trycka på vakuum-knappen på handkontrollen. Vrid och lås 10X mål i PLess. Fokus igen med grova och fina justeringar.
5. Ladda CapSure Macro LCM lock (Life Technologies) i CapSure kassettmodulen och placera ett lock på lasten raden läget. Vrid armen Cap Placering och position runt locket. Höj armen Cap Placering ta bort CapSure locket från kassetten modulen.
6. Vrid armen Cap placering över bilden och sänk armen ner över bilden, vilket placerar locket på bilden. Justera fina fokus och joysticken för att kontrollera om celler är inne den svarta cirkeln på locket. Alla celler fångar bör vara inuti denna svarta cirkeln.
7. Ställ lasern parametrar. Tryck först på laser-aktivera knappen på handkontrollen. Lasern Målet plats kommer att vara synlig som en rosa prick i synfältet på datorskärmen.
8. Ange storlek laserpunkten för små (7,5 um) för att fokusera lasern och justera kraft och varaktighet till 65 till 75 mW för 1,0-2,0 ms som behövs för optimal cellinfångningsanordningen.
9. Test lasern, använda joysticken för att flytta laserpunkten till ett område där det inte finns några celler för att plocka upp. Avfyra lasern med tummen omkopplaren. Använd joysticken för att flytta laserpunkten från den smälta polymeren plats och kontrollera om en synlig mörk ring omger en tydlig område där lasern fick sparken.
10. För att fånga celler använda joysticken för att flytta laserpunkten över området av celler för att fånga. Avfyra lasern med tummen omkopplaren. För joysticken samtidigt avfyra lasern för att fånga ett stort område av celler. När lasern avfyras smälter den termoplastiska polymerfilmen på locket till ytan av målcellerna. Polymeren absorberar laserstrålningen, alltså inte ändra RNA, DNA eller protein säkerställa integriteten av provet för framtida molekylära applikationer.
11. Efter bränning alla celler av intresse, lyft armen Cap Placering. De infångade cellerna kommer att separera från vävnadssnittet och följa CapSure locket. Resterande vävnad och saknade celler kommer att vara gentemotbelt inom synfältet. Cellerna på locket kan också ses genom att placera locket på en tom del av sliden.
12. Lyft armen Cap Placering och rotera den till Cap Lasta Station. Sänk locket till stationen och rotera armen Cap Placering tillbaka till sin tidigare position.
13. Skjut CapSure införingsverktyget längs plattformen och på locket. Lyft verktyget från plattformen. Locket förblir bifogas. Lätt röra locket till CapSure ren pad att rensa bort oönskad vävnad.
14. Placera locket till en 0,5 ml RNas-fri rör fyllt med 100 pl lysbuffert erhållits från RNAqueous Micro Isolation Kit. Omedelbart vortexa locket under 30 sek för att lysera cellerna. Inkubera proverna vid 42 ° C under 30 min och frys vid -80 ° C tills RNA-isolering.

LCM av enstaka FJ + nervceller i hippocampus

15. För att fånga enstaka celler, ladda CapSure HS LCM lock i CapSure kassetten modulen och positipå ett lock på belastningslinjen läget. Vrid armen Cap Placering och placera den runt locket. Höj armen Cap Placering ta bort CapSure locket från kassetten modulen.
16. Ange storlek laserpunkten för små (7,5 um) för att fokusera lasern och justera lasereffekten och varaktigheten till 65 -75 mW för 0,45 till 0,50 msek för optimal cellinfångningsanordningen av enstaka celler.
17. Vrid armen Cap placering över bilden och sänk armen ner mot bilden. Detta kommer att placera locket på bilden. Den Capsure HS lockytan sitter förhöjda från provet under LCM.
18. Använd joysticken för att flytta lasern över enstaka FJ + celler. Alla celler fångas ska vara inne den lilla svarta ringen på locket. Avfyra lasern med tummen omkopplaren.
19. När alla celler i den svarta cirkeln området har avfyrats med lasern, lyft armen Cap Placering. De infångade cellerna kommer att separera från vävnadssnittet och följa CapSure HS locket.
20. Placera en annan bild på microsklara scenen och samla FJ + celler tills HS locket är full. Placera locket till en 0,5 ml RNas-fri rör fyllt med 40-50 il lysbuffert. Omedelbart vortexa locket under 30 sek för att lysera cellerna. Inkubera proverna vid 42 ° C under 30 min och frys vid -80 ° C tills RNA-isolering.

4. Total RNA Isolering från LCM Prover (kommer detta avsnitt bara beskrivas i videopresentation)

1. Totalt RNA från celler isoleras med användning av RNAqueous-Micro Kit (Ambion) enligt tillverkarens protokoll. Alla reagenser och lösningar tvätta finns i detta kit. Förväta mikro filterpatronen montering genom tillsats av 30 pl lyslösning buffert till filtret. Efter 5 minuter, centrifugera filtret för 30 sekunder vid 10.000 x g..
2. Tillsätt 3 | il av LCM tillsats till provet lysatet, till pipett blanda och centrifugera.
3. Lägg 52 il 100% ETOH (1/2 volym) till provet lysatet, pipett att blanda och överföra lysatet till filtretkolonn.
4. Centrifugera filtret kolonnen vid 10.000 x g under 1 min för att binda RNA till kolonnen. Om det finns flera lock för ett prov, snurra varje lysat genom samma kolonn separat.
5. Slutför RNA-isolering förfarande som beskrivs i RNAqueous Micro kit.
6. Utför DNas behandling och DNas inaktivering av LCM RNA-prover som beskrivs i satsen, överföra RNA till en RNas-fri slang och förvara vid -80 ° C.

5. RNA-kvantifiering och nedströmstillämpningar

Bedömning av RNA-kvalitet och kvantifiering utförs med en Agilent Bioanalyzer användning av reagens från Pico Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) enligt tillverkarens protokoll.

1. Totalt RNA analyseras på en Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Programvaran utvärderar koncentrationen och integriteten av RNA-provet genom att tilldela en RNA Integritet Number (RIN) till varje prov sträcker fROM 1 till 10. 1-5 visar försämrade RNA och 7-10 anger god kvalitet RNA.
2. Icke-nedbrutna intakt RNA kommer att användas för Real-Time PCR, individuella Taqman analyser eller RT2 matriser profileringsaggregat med SYBR-grön kemi. RNA kan också användas för mRNA-microarray analys och mikroRNA microarray analys.

I vår första LCM studie kunde vi visa att funktionellt distinkta delregioner (CA1 och CA3) från råtthippocampus har genuttrycksprofilerna som speglar deras sårbarhet för TBI. ⁸ Figur 1A-1C visar laser infångning av hippocampus pyramidala nervceller (CA1- CA3), gyrus dentatus neuroner och neuroner SCN före och efter LCM. Rena fångar i pyramidal, granulat eller neuroner SCN respektive, visas på makro mössor. Figur 2A-2B illustrerar döende, fluor-Jade positiva pyramidala nervceller och överleva, fluor-Jade negativa pyramidala nervceller före och efter LCM. Den rena fånga den döende eller efterlevande nervceller visas genom att visa infångade cellerna på LCM mössor.

Efter LCM kan total-RNA användas för en mångfald av molekylära studier inklusive kvantitativ realtids-PCR-analys av genuttryck med TaqMan eller SYBR Green kemi (Figur 3A), små focused PCR arrayer med SYBR Green prober (Figur 3B) eller hela genomet microarray studier (figur 3C).

Figur 1. Laser fånga mikrodissektion av stråk av definierade cellpopulationer från råtthjärna. Frysta 10 um koronala sektioner av råtthjärna är fixerade i etanol, färgades med en Nissl fläck (kresylviolett) och preparerades för LCM. Visas är bilder på råtta hippocampus och suprachiasmatic kärna före och efter LCM och de infångade celler som visualiseras på makro mössor. A. pyramidala nervceller från CA1-CA3 delområden av råtthippocampus. B. Granule celler i hippocampus dentate gyrus. C. Bilaterala suprachiasmatiska kärnor placerade på vardera sidan av den tredje ventrikelnoch ovanför den optiska chiasma. Klicka här för att se större bild .

Figur 2. Laser fånga mikrodissektion av enstaka nervceller från råtta hippocampus. Här visas A. degenererar, fluor-Jade-positiva (färgade) hippocampus CA3 nervceller och B. överleva, fluor-Jade-negativ (ofärgade) CA3 nervceller före och efter LCM. Tagna celler visualiseras. Klicka här för att se större bild .

Figur 3. Genuttryck analys av totalt RNA isolerat från laser infångade neuroner. A. Kvantitativa real time PCR data dygnsrytm klocka genuttryck i SCN. B. heatmap av genexpression i döende och överlevande hippocampala neuroner visar expression av apoptos-relaterade gener med fokuserade PCR arrayer . C. Agilent hel-genomet microarray analys av genuttryck i hippocampus CA1-CA3 neuroner från råttor som fått simulerad skada, TBI eller TBI plus en rekombinant adenoassocierat virus siRNA avsedd att ÖVERVÄLDIGANDE uttryck av gener som induceras av hjärnskada (neuronal kväveoxid syntas och glutationperoxidas-1). Klicka här för att se större bild .

Denna LCM teknik har gjort det möjligt för oss att göra betydande framsteg i att förstå de molekylära mekanismer TBI. ^{8,10,11,12,13} Vi var de första utredarna att utnyttja denna teknik för att visa att olika delområden av råtthippocampus har genuttrycksprofilerna som korrelera med deras selektiva känslighet för skada. Våra studier visade att vi kunde mäta genuttryck, av qPCR från så lite som 10 fångade laser celler och att vi kunde utföra genomet hela microarray analys från så få som 600 fångade celler. LCM skulle vara ett värdefullt verktyg i liknande studier av andra delar av hjärnan som är kända för att vara inblandade i olika neurologiska och neuropsykiatriska sjukdomar. Till exempel har studier med LCM belysa i patogenesen av Parkinsons sjukdom i dopaminneuroner i substantia nigra, ¹⁴ och understödda genomet hela profilering studier av nucleus accumbens, som är involverat i belöning kretsar inblandade i substance missbruk störningar. ¹⁵

Neuronal heterogenitet återspeglas på genomnivå ¹⁶ och kan bidra till den bristande framgången för experimentella behandlingar för TBI i kliniska prövningar. Således är vårt mål att utnyttja denna teknik för att undersöka de kritiska delarna påverkar neuronal överlevnad efter TBI. Vår senaste genomet hela profilering studie av döende och angränsande överlevande hippocampala neuroner efter TBI föreslog att en cellulär reostat som återspeglar förhållandet mellan expressionsnivåema av cellöverlevnad till gener celldöd reglerar cellens öde efter TBI. Dessa pågående studier kommer att bidra till utformningen och utvecklingen av farmakoterapeutiska strategier som positivt kan påverka reostat cellöverlevnad. Dessutom använder vi nu LCM att spåra och övervaka effekterna av potentiella terapeutiska läkemedelsbehandlingar i hippocampus nervceller efter TBI. Således våra studier visar att grundligt RNas-fria hanteringstekniker och någramodifieringar av befintliga protokoll, är det möjligt att erhålla högkvalitativa RNA-prov från LCM för noggrann kvantitativ genuttrycksanalys.

Men det finns några fallgropar som är förknippade med LCM tekniker. Till exempel, kan samla endast neuronala celler utan någon mikroglia kontamination vara nästan omöjligt. I pyramidala cellskiktet i hippocampus har det uppskattats att 95% av cellerna är nervceller med 90% av denna befolkning att vara pyramidala celler och 10% interneuronen, lämnar en liten andel av glia och andra celltyper. ^{8,17, 18} I våra studier använder vi fluor-jade en fluorescerande färg som specifikt märker bara skadade nervceller i hjärnvävnad. En annan fläck som är en markör för GFAP skulle vara nödvändigt att färga mikroglia. ¹⁹ Samla endast fluor-jade färgade enda neuronala kroppar ger en mer homogen population av neuroner. Ett annat vanligt problem som kan kräva felsökning är att en cirkel intet definieras när lasern avfyras. Om detta inträffar, är det nödvändigt att kontrollera laser inställningar och justera effekten och varaktigheten som behövs. Det är också viktigt att säkerställa att locket placeras plant på vävnaden och sitter ordentligt i armen. Med hänvisning till LCM tekniska manualen eller ringa teknisk support kommer ibland att vara nödvändig. Efter LCM och RNA isolering, bör kvaliteten på RNA alltid bedömas med hjälp av en bioanalyzer innan någon genuttryck analys.

Det finns flera typer av instrument laser capture närvarande finns på marknaden, inklusive laserskärning (Life Technologies, Leica Microsystems) och laser catapulting (Zeiss) instrument. Vårt LCM system fungerar bra för att fånga små mängder celler. Andra hög genomströmning och mer automatiserade system kan vara mer lämplig för att erhålla ett större antal celler för genomisk och särskilt proteomic analys. Faktum är LCM använda dessa automatiska system stor potential för analys av protein uttryck i identifierade celler eller berikade populationer av celler. ²⁰ Vidare kan LCM underlätta analys genuttryck av immunolabeled celler, ²¹ gör att vi kan undersöka genuttryck i definierade celltyper oavsett komplexiteten i de mest heterogena vävnader. Således är LCM ett utmärkt verktyg för banbrytande molekylära studier av enstaka eller anrikade populationer av celler.