Vi beskriver, hvordan du bruger laser capture mikrodissektion (LCM) for at opnå berigede populationer af hippocampus neuroner eller enlige neuroner fra frosne dele af den sårede rottehjerne til efterfølgende genekspressionsanalyse ved brug af kvantitativ real-time PCR og / eller hel-genom microarrays.
Langsigtet kognitive handicap efter TBI er forbundet med skade-induceret neurodegeneration i hippocampus-en region i den mediale tindingelappen, der er afgørende for indlæring, hukommelse og udøvende funktion. 1,2 Deraf vores undersøgelser fokuserer på genekspression analyse af specifik neuronal populationer i særskilte underområder i hippocampus. Teknikken med laseropfangnings-mikrodissektion (LCM), blev indført i 1996 af Emmert-Buck, et al. Tre har muliggjort betydelige fremskridt inden for genekspression analyse af enkelte celler og berigede populationer af celler fra heterogene væv, såsom pattedyrs hjerne, der indeholder tusinder af funktionelle celletyper. fire Vi bruger LCM og en veletableret rottemodel for traumatisk hjerneskade (TBI) til at undersøge de molekylære mekanismer, der ligger til grund for pathogenesen af TBI. Efter fluidperkussion TBI, er hjerner fjernes på forudbestemte tidspunkter efter skaden, straks frosset på tøris,og forberedes til skæring i en kryostat. De rottehjerner kan indlejres i OLT og snittet straks eller gemmes flere måneder ved -80 ° C før sektionering til laser capture mikrodissektion. Derudover bruger vi LCM at studere virkningerne af TBI på døgnrytmen. Til dette fange vi neuroner fra suprachiasmatiske nuclei, som indeholder hovedkloksignalet i pattedyrs hjerne. Her viser vi anvendelse af LCM at opnå enkelte identificerede neuroner (skadet og degenererende, fluor-Jade-positive, eller ubeskadiget, fluor-Jade-negative) og berigede populationer af hippocampale neuroner for efterfølgende genekspressionsanalyse ved real time PCR og / eller hel-genom microarrays. Disse LCM-baserede undersøgelser har vist, at den selektive sårbarhed anatomisk distinkte områder af rottehippocampus afspejles i de forskellige genekspressionsprofiler fra forskellige populationer af neuroner opnået ved LCM fra disse forskellige områder. Resultaterne fra vores encellede studier, hvorvi sammenligner de transkriptionelle profiler for at dø og tilstødende overlevende hippocampale neuroner, at der eksisterer en celleoverlevelse rheostat, der regulerer celledød og overlevelse efter TBI.
Genekspressionsanalyse af heterogene væv har altid været problematisk. Dette gælder især i pattedyrhjernen, som har cirka 5.000 forskellige celletyper 4 Forud for udviklingen af laseropfangnings-mikrodissektion (LCM) teknik, genomiske undersøgelser af virkningerne af TBI in vivo blev baseret på analyse af genekspression i en blandet population af hjernen omfattede celler, ikke kun af forskellige neuronale celletyper, men også for at støtte glial og immunmodulerende celler. De resulterende komplekse genekspressionsprofiler opnået fra disse heterogene væv, og de ofte modstridende mønstre af skade-inducerede cellulære signaler, kan være en forklaring på den manglende i humane kliniske undersøgelser af terapeutiske strategier vist sig effektiv i prækliniske studier af TBI. 5
For at opnå en klar forståelse af skade-induceret genekspression i sårbare populationer af neuroner fra rotte hoftepocampus vedtog vi en teknik, LCM, først rapporteret af Emmert-Buck et al. 3 Efterfølgende vi modificeret og optimeret denne mikrodissektion teknik til effektiv opsamling af beriget populationer af neuroner og enlige neuroner til mRNA profilering ved hjælp af kvantitativ real-time PCR og microarray analyse . At opretholde integriteten af mRNA i frosne snit af hjernevæv for genomisk analyse, vi modificeret eksisterende protokoller til fastsættelse farvning og hurtig opsamling af neuroner fra frosne rottehjerne sektioner. Til identifikation og isolering af beskadigede og døende hippocampale neuroner har vi også optimeret Fluoro-Jade farvningsteknik for LCM. Fluor-Jade skelner ikke mellem apoptotisk og nekrotisk celledød. Således kan alle typer af degenererende neuroner påvises ved denne farvning. 6,7
Her beskriver vi den protokol, der anvendes i vores laboratorium for at få puljer af enkelt dør eller overlever neuroner samt skår af beriget populations af forskellige neuronale celletyper (dvs. CA1-CA3 neuroner for genekspressionsanalyse efter TBI). Proceduren for fluid percussion hjerneskade udført i vores laboratorium er beskrevet i detaljer i Shimamura et al. 8 og er meget lig den lateral fluidperkussion skade protokol for mus offentliggjort i Jove af Alder et al. 9 Da LCM teknik har vist sig at have minimal eller ingen virkning på integriteten af DNA, RNA og protein i væv, er et udmærket værktøj for molekylær-og proteinanalyse af definerede celletyper.
Denne LCM teknik har gjort det muligt for os at gøre betydelige fremskridt i forståelsen af de molekylære mekanismer i TBI. 8,10,11,12,13 Vi var de første forskere til at udnytte denne teknik til at vise, at forskellige subregioner af rotte hippocampus har genekspressionsprofiler at korrelerer med deres selektive sårbarhed over for skader. Vore undersøgelser viste, at vi kunne kvantificere genekspression ved qPCR, fra så få som 10 laser opfangede celler, og at vi kunne udføre genomet hele microarray analyse fra så få som 600 opfangede celler. LCM ville være et værdifuldt værktøj i lignende undersøgelser i andre områder af hjernen, der vides at være impliceret i forskellige neurologiske og neuropsykiatriske lidelser. For eksempel har undersøgelser med LCM belyse i patogenesen af Parkinsons sygdom i dopaminerge neuroner i substantia nigra, 14 og hjulpet genom-dækkende profilering undersøgelser af nucleus accumbens, der er involveret i belønning kredsløb impliceret i substance misbrug lidelser. 15
Neuronal heterogenitet der reflekteres fra genomplan 16 og kan bidrage til den manglende succes af eksperimentelle behandlinger for TBI i kliniske forsøg. Således er vores mål er at udnytte denne teknik til at undersøge de kritiske elementer påvirker neuronal overlevelse efter TBI. Vores nylige genomet hele profilering undersøgelse for at dø og tilstødende overlevende hippocampale neuroner efter TBI foreslået, at et cellulært rheostat, der afspejler forholdet mellem ekspressionsniveauerne af celleoverlevelse til celledød gener regulerer cellens skæbne efter TBI. Disse igangværende studier vil bidrage til udformning og udvikling af farmakoterapeutiske strategier, der kan have en positiv indflydelse på celleoverlevelse rheostat. Endvidere har vi i øjeblikket bruger LCM at spore og overvåge virkningerne af potentielle terapeutiske lægemiddelbehandlinger i hippocampus neuroner efter TBI. Således vores undersøgelser viser, at givne omhyggelige RNase-fri håndteringsteknikker og nogleændringer af eksisterende protokoller, er det muligt at opnå en høj kvalitet RNA-prøver fra LCM for præcis kvantitativ genekspressionsanalyse.
Men der er et par faldgruber, der er forbundet med LCM teknikker. For eksempel kan indsamle kun neuronale celler uden microglia kontaminering være næsten umuligt. I det pyramidale cellelag i hippocampus er det blevet anslået, at 95% af cellerne er neuroner med 90% af denne population for at være pyramideformede celler og 10% interneuroner, hvilket efterlader en lille procentdel af gliale og andre celletyper. 8,17, 18 I vores undersøgelser har vi bruger Fluoro-jade et fluorescerende farvestof, som specifikt kun etiketter tilskadekomne neuroner i hjernevæv. En anden plet, der er en markør for GFAP ville være nødvendigt at farve microglia. 19 Indsamling kun Fluoro-jade farvede enkelt neuronale organer sikrer en mere homogen population af neuroner. Et andet fælles problem, der kan kræve fejlfinding er, at en cirkel ikket defineret, når laseren er fyret. Hvis dette sker, er det nødvendigt at kontrollere laser indstillinger og justere effekten og varigheden efter behov. Det er også vigtigt at sikre, at hætten er placeret fladt på vævet og placeret korrekt i armen. Under henvisning til LCM teknisk manual eller ringe teknisk support vil nogle gange være nødvendigt. Efter LCM-og RNA-isolering, bør kvaliteten af RNA'et altid vurderes under anvendelse af en bioanalyzer forud for enhver genekspressionsanalyse.
Der findes flere typer af laser capture instrumenter på markedet i øjeblikket, herunder laserskæring (Life Technologies, Leica Microsystems) og laser catapulting (Zeiss) instrumenter. Vores LCM system fungerer godt til optagelse af et lille antal celler. Andre high-throughput og mere automatiserede systemer kan være mere egnede til opnåelse af større antal celler til genomisk og især proteom analyse. Faktisk LCM anvendelse af disse automatiske systemer har et stort potentiale for analyse af protein ekspression i identificerede celler eller berigede populationer af celler. 20 Endvidere kan LCM lette genekspressionsanalyse af immunolabeled celler, 21 gør det muligt for os at undersøge genekspression i definerede celletyper uanset kompleksiteten i de mest heterogene væv. Således LCM er et fremragende værktøj til cutting-edge molekylære studier af enkelte eller berigede populationer af celler.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde er finansieret af R01 NS052532 (til HLH), den Moody Foundation, og Institut for Anesthesiology. Vi takker Laurie Bolding, Christine Courteau Butler og Christy Perry for deres redaktionelle assistance, og Christy Perry til layout og fremragende produktion af alle figurer, tabeller og illustrationer.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |