Vi beskriver metoder til live-cell video mikroskopi af<em> Candida albicans</em> Fagocytose med makrofager. Disse metoder sikrer fase-specifik analyse af makrofag migration, anerkendelse, engulfment og phagosome modning og afslører hidtil ukendte sider af fagocytose.
Fagocytiske clearance af patogene svampe, og mikroorganismer mere generelt, kan anses for at bestå af fire forskellige faser: (i) migration af fagocytter til det sted, hvor patogener er placeret, (ii) anerkendelse af patogen-associerede molekylære mønstre (PAMPs) gennem mønster anerkendelse receptorer (PRRS), (iii) engulfment af mikroorganismer bundet til den fagocyt cellemembran, og (iv) behandling af opslugt celler inden modning phagosomes og fordøjelse af den indtagne partikel. Undersøgelser der vurderer fagocytose i sin helhed er informative 1, 2, 3, 4, 5 men er begrænset ved, at de ikke normalt bryde processen ned i migration, engulfment og phagosome modning, hvilket kan påvirkes differentielt. Endvidere disse undersøgelser vurderer optagelse som en enkelt begivenhed, snarere end som en kontinuerlig dynamisk proces. Vi har for nylig udviklet avancerede live-cell imaging teknologier, og har kombineret disse med genetisk funktionel analyse af bådepatogene og værtsceller for at skabe en tværgående platform til analyse af medfødte immuncelle funktion og fungal patogenese. Disse undersøgelser har afsløret hidtil ukendte aspekter af fagocytose, der kun kunne observeres ved hjælp af systematisk tidsmæssig analyse af de molekylære og cellulære vekselvirkninger mellem menneskelige fagocytter og svampepatogener og smitsomme mikroorganismer mere generelt. For eksempel har vi begyndt at angive følgende: (a) komponenterne af celleoverfladen kræves for hvert trin i processen anerkendelse, engulfment og drab af svampeceller 1, 6, 7, 8, (b) hvor overfladegeometri påvirker effektiviteten af makrofagoptagelse og drab af gær og svampetrådenes celler 7, og (c) hvor engulfment fører til ændring af cellecyklussen og opførsel af makrofager 9, 10.
I modsætning til enkelt tidspunkt snapshots, muliggør live-cell video mikroskopi mange forskellige værtsceller og patogener, der skal studeres som continuous sekvenser over lange tidsperioder, der giver rumlige og tidsmæssige oplysninger om en bred vifte af dynamiske processer, herunder celle migration, replikering og vesikulær menneskehandel. Her beskriver vi i detaljer, hvordan man forbereder vært og svampeceller, og foretage video mikroskopi eksperimenter. Disse fremgangsmåder kan give en bruger-guide for fremtidige undersøgelser med andre fagocytter og mikroorganismer.
Her fremgangsmåden til anvendelse af levende-celle video mikroskopi at undersøge makrofag-fagocytose er beskrevet. Video mikroskopi tilbyder flere ekstra lag af information til analyse. En grundlæggende fordel er, at optagelses-data kan genereres (fra et enkelt eksperiment) for ethvert tidspunkt gennem 6 timers observationsperiode. Hvad vigtigere er, den beskrevne metode muliggør differentieret analyse af de enkelte faser af fagocytose. Vi har for eksempel vist, at ændringer af den samlede optagelse af C. albicans glycosylering og morfogenese mutanter af makrofagcellelinier og primære makrofager kan enten være en følge af ændringer i makrofag migration hen imod målceller eller hastigheden af engulfment når celle-celle-kontakt er etableret 7.
Der er en række faldgruber for at undgå, når de foretager disse eksperimenter. For det første er det meget vigtigt at sikre stabile miljøforhold i forsøgsperioden procedure. Dette opnås bedst i et klimakammer, der er indstillet til de eksperimentelle betingelser flere timer før påbegyndelse af forsøget. Video kvalitet er meget afhængig af avancerede moduler, der bruger infrarøde lasere til automatisk at opretholde prøven z-position uanset mekaniske eller termiske forandringer hvilket eliminerer behovet for manuel fokus korrektioner.
I betragtning af den udvidede karakter af forsøgene er det vigtigt at begrænse laserlys eksponering og fotoblegning og fotoomdannelse virkninger, som kan minimeres ved anvendelse af stærkt fluorescerende markører, som letter lav eksponeringstider. Den FITC farvningsprotokol beskrevet her er hurtig og pålidelig. Da FITC er en meget lys og stabil pletten, lave eksponeringstider er påkrævet, og det gør FITC ideel til længere time-lapse film. Men vi anvender rutinemæssigt en række forskellige mål pletter, herunder Calcofluor White og PKH farvestoffer samt mærkede organismer.
<p class = "jove_content"> De fleste af vores offentliggjorte arbejde udføres ved hjælp af en bred felt mikroskop, men eksponering kan yderligere minimeres ved hjælp af en roterende skive konfokal mikroskop og i vores hænder dette er afgørende for time-lapse 3D-video mikroskopi.Under denne undersøgelse blev billeder optaget med 1 min intervaller over en 6 timers fagocytose-assay. Intervallet mellem billeder kan justeres afhængig af processen, der undersøges. For eksempel kan intervallet nedsættes, når de efterforsker hurtige processer såsom vesikulær menneskehandel. Det mindste tidsinterval vil blive begrænset af mikroskop og kameraet specifikationer. Der er nogle overvejelser at huske på, når justering tider. Først vil mindske intervallet mellem snapshots betyde færre point kan afbildes og filstørrelse vil blive væsentligt forøget. Tværtimod vil øge billedet interval for meget make filmen mister kontinuitet.
Denne fremgangsmåde kan anvendesi princippet til at studere andre patogener og optag af døende værtsceller. For eksempel har vi for nylig vist, at knoglemarvsceller afledte makrofager fra sialoadhesin-deficiente mus i høj grad udviser reduceret binding og fagocytose af sialyleret Campylobacter jejuni 8. Imidlertid målstørrelse er en vigtig determinant for gennemførligheden, som billedanalyse bliver stadig sværere med en reduktion i målcelle størrelse. Sofistikeret billede analyse software er afgørende for hurtig video mikroskopi analyse, og dette bør kombineres med passende bioinformatik til fremme af generation af algoritmer til at studere migration af de enkelte celler og hele cellepopulationer 7. Live-celle video mikroskopi i kombination med sofistikeret billede analyse software til minut-for-minut analyse af migration og individuelle makrofag-C.albicans interaktioner, giver unik indsigt i kompleksiteten af C. albicans fagocytose af macrophages. Der er et enormt potentiale for at udvide disse metoder til at studere andre patogener og fagocytter (dendritiske celler, neutrofile) og at udvikle 3D-video mikroskopi til billede celle-celle interaktioner i nærmere eller på flere fysiologiske overflader, såsom epitel og endotel cellelag. Denne teknik er en del af den næste generation af værktøjer i studiet af værtspatogene interaktioner og vil hjælpe med at generere detaljerede rumlige og tidsmæssige oplysninger om en bred vifte af dynamiske processer.
The authors have nothing to disclose.
LPE er en skotsk Senior Clinical Fellow og anerkender støtte fra Chief Scientist Office (SCD/03). Dette arbejde blev finansieret af Wellcome Trust Project Grant til LPE (089.930). NARG blev finansieret af en Wellcome Trust Programme Grant (080.088) og et udstyr Grant (075.470) (for DeltaVision), og ved et FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010 til 260.338-Allfun). Vi vil gerne takke University of Aberdeen imaging facilitet, og især Kevin MacKenzie, for hjælp og støtte og rådgivning.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
NaOH | Sigma | S5881-500G |
Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
FITC | Sigma | F7250-1G |
Sodium carbonate | BDH | 301215M |
Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
PBS | Gibco | 18912-014 |
DMEM | Lonza | BE12-614F |
FCS | Life Technologies | 10106169 |
Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |