الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية
Summary
وصفنا طرق للفحص المجهري لقطات فيديو حية من خلايا<em> المبيضات البيض</em> البلعمة من قبل الضامة. هذه الأساليب تمكن مرحلة محددة تحليل للهجرة البلاعم، والاعتراف، والإحاطة النضج يبلوع وتكشف عن جوانب جديدة من البلعمة.
Abstract
إزالة مسببات الأمراض الفطرية من أكلة، والكائنات الحية الدقيقة بصورة عامة، يمكن اعتبار أن تتكون من أربع مراحل متميزة: (ط) من الهجرة البالعات إلى موقع حيث توجد الكائنات الممرضة، (الثاني) الاعتراف الممرض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) من خلال نمط مستقبلات الاعتراف (PRRs)، (الثالث) من الكائنات الحية الدقيقة الإحاطة منضمة إلى غشاء الخلية بلعمية، و (رابعا) من الخلايا المعالجة اجتاحت داخل phagosomes النضج والهضم للجسيمات بلعها. تقييم الدراسات التي البلعمة في مجملها هي برامج إعلامية 1، 2، 3، 4، 5 لكنها محدودة من حيث أنها لا كسر عادة أسفل إلى عملية الابتلاع، والهجرة ونضوج يبلوع، والتي قد تتأثر بشكل مختلف. وعلاوة على ذلك، مثل هذه الدراسات تقييم امتصاص كحدث واحد، بدلا من أن تكون عملية ديناميكية مستمرة. وقد وضعنا مؤخرا المتقدمة تقنيات التصوير الخلية الحية، وتضافرت هذه مع التحليل الوظيفي لكلا الوراثيةالممرض والمضيف الخلايا لخلق منصة متعددة التخصصات لتحليل الفطرية وظيفة الخلايا المناعية الفطرية والمرضية. وقد كشفت هذه الدراسات جوانب من رواية البلعمة أنه لا يمكن ملاحظتها باستخدام التحليل الزمني المنتظم للتفاعلات الجزيئية والخلوية بين البالعات الإنسان ومسببات الأمراض الفطرية والكائنات الدقيقة المعدية بشكل عام. على سبيل المثال، بدأنا لتحديد ما يلي: (أ) مكونات سطح الخلية المطلوبة لكل مرحلة من مراحل عملية الابتلاع، والاعتراف وقتل الخلايا الفطرية 1، 6، 7، 8، (ب) الهندسة سطح كيف يؤثر على كفاءة امتصاص البلاعم وقتل الخميرة والخلايا خوطي 7؛ و (ج) كيف الإحاطة يؤدي إلى تغيير في دورة الخلية وسلوك الضامة 9 و 10.
وعلى النقيض من واحد لقطات نقطة زمنية، ويعيش خلايا المجهري الفيديو تمكن مجموعة واسعة من الخلايا المضيفة ومسببات الأمراض التي يتعين دراستها كما شاركntinuous متواليات على مدى فترات زمنية طويلة، وتوفير المعلومات المكانية والزمانية على مجموعة واسعة من العمليات الحيوية، بما في ذلك الهجرة الخلية، والنسخ والاتجار حويصلي. نحن هنا وصف بالتفصيل كيفية إعداد المضيف والخلايا الفطرية، وإجراء التجارب المجهري الفيديو. يمكن توفير هذه الأساليب من قبل المستخدم دليل للدراسات المستقبلية مع البالعات الأخرى والكائنات الحية الدقيقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يتم وصف طريقة لاستخدام المجهر لقطات فيديو حية خلايا البلعمة لدراسة البلاعم. المجهر الفيديو يوفر طبقات متعددة من المعلومات الإضافية لتحليلها. واحد الميزة الأساسية هي أن البيانات يمكن أن تتولد امتصاص (من تجربة واحدة) عن أي نقطة زمنية خلال الفترة من 6 الملاحظة ساعة. الأهم من ذلك، يمكن وصف أسلوب التحليل التفاضلي للمراحل البلعمة الفردية. لدينا، على سبيل المثال، أظهرت أن التغيرات في امتصاص العام للC. يمكن البيض ارتباط بالغليكوزيل والمسوخ التشكل من خطوط الخلايا الضامة والبلاعم الأولية يكون إما نتيجة للتغيرات في الهجرة نحو البلاعم أو الخلايا المستهدفة معدل الإحاطة مرة واحدة خلية خلية الاتصال يتم تأسيس 7.
هناك عدد من لتجنب المزالق عند إجراء هذه التجارب. أولا، من المهم جدا لضمان الظروف البيئية المستقرة في جميع أنحاء اإلجراءات التجريبية dure. ويتحقق هذا أفضل في غرفة البيئية التي تم تعيينها للشروط التجريبية عدة ساعات قبل بدء التجربة. جودة الفيديو تعتمد اعتمادا كبيرا على وحدات متطورة ليزر الأشعة تحت الحمراء التي تستخدم للحفاظ على عينة تلقائيا Z-موقف بغض النظر عن التغييرات الميكانيكية أو الحرارية وبالتالي القضاء على الحاجة إلى التركيز اليدوي التصحيحات.
نظرا لطبيعة ممتدة من التجارب، من المهم للحد من التعرض للضوء ليزر وما يرتبط بها من آثار وphotobleaching photoconversion، والتي يمكن أن يكون الحد الأدنى من خلال توظيف علامات الفلورسنت للغاية، والتي تسهل مرات التعرض المنخفضة. بروتوكول الموصوفة هنا تلطيخ FITC سريعة وموثوق بها. كما هو مطلوب FITC مشرق جدا ومستقرة وصمة عار، وأوقات التعرض المنخفضة وهذا ما يجعل مثالية للأفلام FITC الوقت الفاصل بين الموسعة. ومع ذلك، ونحن نستخدم بشكل روتيني مجموعة متنوعة من البقع المستهدفة المختلفة، بما في ذلك الأصباغ والأبيض Calcofluor PKH وكذلك الكائنات المفتاحية.
<p cمعشوقة = "jove_content"> ويجري معظم عملنا نشرت باستخدام مجهر اسعة المجال، ولكن يمكن التقليل من التعرض مزيد باستخدام المجهر متحد البؤر القرص الغزل وبين أيدينا هذا أمر ضروري لمرور الزمن المجهر الفيديو 3D.خلال هذه الدراسة تم التقاط الصور على فترات أكثر من حد أدنى 1 مقايسة البلعمة 6 ساعة. ويمكن تعديل الفاصل الزمني بين الصور اعتمادا على عملية قيد التحقيق. على سبيل المثال، يمكن أن تنخفض الفاصل عند التحقيق السريع مثل عمليات الاتجار حويصلي. وستقتصر الفترة الزمنية الدنيا من المواصفات المجهر والكاميرا. هناك بعض الاعتبارات أن يوضع في الاعتبار عند تعديل توقيت. أولا، سوف تقليل الفاصل الزمني بين لقطات يعني ولا يمكن تصوير أقل نقطة وسيتم زيادة حجم الملف كبير. على العكس من ذلك، سوف زيادة الفاصل الزمني الصورة كثيرا جعل الفيلم يفقد الاستمرارية.
ويمكن تطبيق هذا النهجمن حيث المبدأ لدراسة مسببات الأمراض الأخرى وامتصاص الخلايا للموت المضيف. على سبيل المثال، لقد أظهرنا مؤخرا الذي يحمل تقلص إلى حد كبير نقي العظم الضامة المستمدة من الفئران التي تعاني من نقص sialoadhesin ملزمة والبلعمة من الصائمية العطيفة sialylated 8. ومع ذلك، حجم الهدف هو من العوامل الهامة للجدوى، وتحليل الصور يصبح من الصعب على نحو متزايد مع انخفاض في حجم الخلية المستهدفة. برامج متطورة تحليل الصور ضروري لتحليل الفيديو السريع المجهري، وينبغي أن يقترن هذا مع دعم المعلوماتية الحيوية المناسبة لتسهيل توليد خوارزميات لدراسة هجرة الخلايا الفردية والسكان الخلية بأكملها 7. الخلية الحية المجهري الفيديو في تركيبة متطورة مع صورة برامج التحليل لتحليل دقيقة تلو الدقيقة للهجرة والفردية التفاعلات البلاعم-كانديدا البيكانز، يقدم رؤية فريدة من نوعها في تعقيد C. البيض البلعمة من قبل macrophagوفاق. هناك إمكانات هائلة لتوسيع هذه الأساليب لدراسة مسببات الأمراض الأخرى والبالعات (الخلايا الجذعية، والعدلات) ووضع الفيديو إلى 3D المجهر التفاعلات الخلية خلية صورة بمزيد من التفصيل أو أكثر على الأسطح الفسيولوجية مثل طبقات الخلايا الظهارية والبطانية. هذه التقنية هي جزء من الجيل القادم من أدوات في دراسة المضيف الممرض التفاعلات وسوف يساعد على توليد معلومات مفصلة المكانية والزمانية على مجموعة واسعة من العمليات الحيوية.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LPE هو زميل الاسكتلندي السريرية كبير ويعترف بدعم من مكتب كبير العلماء (SCD/03). وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المشروع ويلكوم ترست المنح لLPE (089930). وقد تم تمويل المنح من قبل NARG ويلكوم ترست برنامج (080088) ومنحة معدات (075470) (للDeltaVision)، ومنحة FP7-2007-2013 (HEALTH-F2-2010-260338-ALLFUN). نود أن نشكر جامعة أبردين مرفق التصوير، في ماكينزي كيفن وجه الخصوص، للحصول على الدعم والمشورة مفيدة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
| NaOH | Sigma | S5881-500G |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
| FITC | Sigma | F7250-1G |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
| PBS | Gibco | 18912-014 |
| DMEM | Lonza | BE12-614F |
| FCS | Life Technologies | 10106169 |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
Referenzen
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -. P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
