活细胞视频显微镜病病原菌的吞噬作用

1。C.白色念珠菌的生长和条件准备SC-URA琼脂平板上，通过加入6.9克无氨基酸的酵母氮碱，1毫升1 M NaOH溶液，10毫升1％（重量/体积）腺嘌呤hemisulphate盐和20克技术琼脂（先前11中详细描述）。化妆用蒸馏水，H 2 O的体积至900毫升高压灭菌器，允许琼脂冷却，但还不够巩固，然后在无菌条件下，添加50毫升无菌的40％D-葡萄糖和50毫升无菌4％SC-URA辍学。混合，倒入培养皿中，并留下琼脂平板上，冷却和固化。商店琼脂平皿上，在5℃下直至使用。 数C。白色念珠菌血清型的菌株CAI4 + CIp10从甘油保存于-80°C到SC-URA琼脂平板上。 孵育板在30°C至菌落形态和存储在5°C。 文化单一C. SC-URA在5毫升培养基（配方在1.1，但没有技术的琼脂）和白色念珠菌殖民地孵育过夜30℃，200 rpm到生成固定相C.白色念珠菌 。 2 C.白色念珠菌染色异硫氰酸荧光素（FITC） 加入10微升C.白色念珠菌 990微升PBS（pH 7.4）中，并过夜培养，使用血球计进行细胞计数。 为了帮助可视化C.吞噬作用测定期间的白色念珠菌 ，染色剂1×10 8 C。白色念珠菌在0.05M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH9.6）在室温下在黑暗中10分钟，用1毫克/毫升FITC。 要除去未结合的FITC，洗C.白色念珠菌在1毫升1×PBS中，离心机在3000×g下5分钟，去除上清液，沉淀重悬在1ml 1×PBS。重复3次。 重悬浮沉淀，在1×10 6细胞/μl，以1×PBS。 3。 J774.1小鼠巨噬细胞系的制备保持在75厘米2组织J774.1巨噬细胞在DMEM培养基的培养瓶中补充有10％（V / V）胎牛血清（FCS），200 U / ml青霉素/链霉素和2mM的L-谷氨酰胺，37℃，5％CO 2的 。原发性巨噬细胞的制备12，13中详细描述的其他地方。 刮J774.1细胞从组织培养烧瓶中，并转移到一个50毫升Falcon管中。在600×g下离心5分钟，得到的细胞沉淀。 去除上清，重悬沉淀在10ml预先温热的补充的DMEM培养基中。计数细胞，用血细胞计数板1×10 6 J774.1巨噬细胞在2ml补充的DMEM培养基，在35毫米的玻璃为基础的成像菜。孵育过夜，在37℃，5％CO 2。 成像前，取代补充的DMEM培养基中，用2毫升预加热补充CO 2独立的介质（有10％（V / V）胎牛血清（FCS），200 U / ml青霉素/链霉素和2mM的L-谷氨酰胺） 1的μMLysoTracker红DND-99。 4。活细胞视频显微细胞吞噬功能测定显微镜的选择将取决于什么是本地可用，但在显微镜设置将需要包括一个倒置的阶段，环境室，加热至37℃，并激发/发射过滤器的所选择的污渍（FITC和TRITC）。 打开显微镜上的加热器在实验前，留出足够的时间对环境的控制腔升温到37°C。室温度稳定所需的时间会有所不同，不同的显微镜设置。 显微镜和电脑，打开和加载的图像处理软件。安装盘上的显微镜载物台的成像和调整的重点，找到J774.1巨噬细胞。优化TRITC和DIC图像的外观，通过调整透射光的百分比和曝光时间。 取出成像菜和添加3×10 6 FITC染色C.白色念珠菌为t他的菜。记录的时间，C.白色念珠菌的菜。菜的阶段，并优化如有必要，FITC图像的外观。如果需要的话，设置了积分榜。 开始成像时，所有的点都聚焦和渠道进行了优化。捕获FITC，TRITC和DIC的图像，每分钟6小时。