Faciliteren Drug Discovery: een geautomatiseerde high-content Ontsteking Assay in de zebravis
Summary
Hier beschrijven we een nieuwe, hoge-inhoud chemisch geinduceerde ontsteking test met het oog op de identificatie van immuun-modulerende bioactieve. We hebben met succes gecombineerd geautomatiseerde microscopie met op maat ontwikkelde software scripts voor directe kwantificering van de ontstekingsreactie en verdere verwerking van gegevens, analyse, mijnbouw, en opslag.
Abstract
Zebravissen larven bijzonder vatbaar hele dier moleculen schermen 1,2 door hun kleine afmetingen en het relatieve gemak van manipulatie en waarneming, en dat verbindingen eenvoudig kan worden toegevoegd aan het zwemwater en gemakkelijk opgenomen indien toegediend in een <1% DMSO-oplossing. Door de optische helderheid van zebravis larven en de beschikbaarheid van transgene lijnen expressie fluorescente eiwitten in leukocyten, zebravis bieden het unieke voordeel bewaken van een inflammatoire respons in vivo. Bijgevolg is het gebruik zebravis voor hoge gehalte moleculen schermen ter vaststelling van immuun-modulerende verbindingen met hoge doorvoer voorgesteld 3-6, suggereert ontsteking inductie's bijvoorbeeld gelokaliseerd inkepingen in fin weefsel laser schade naar de dooier oppervlak embryo's 7 of staart amputatie 3,5,6. Het grote nadeel van deze methoden was echterde vereiste handmatige manipulatie larve verwonding induceren, waardoor voorkomen hoge doorvoer screen. Introductie van het chemisch geïnduceerde ontsteking (kin) test 8 geëlimineerd deze obstakels. Aangezien de verwonding is toegebracht chemisch het aantal embryo's dat tegelijkertijd behandeld kunnen worden is vrijwel onbeperkt. Tijdelijke behandeling van zebravis larven met kopersulfaat induceert selectief celdood in haarcellen van de zijlijn systeem en resulteert in een snelle granulocyten rekrutering van gewonde neuromasts. De ontstekingsreactie te volgen in real-time met verbinding transgene cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 6,9 zebravis larven die een groen fluorescerend eiwit in neuromast cellen en een rood fluorescent eiwit labeling granulocyten geven.
Om een screening strategie die het mogelijk zowel hoge-content en high-throughput analyses bedenken introduceerden we robots het hanteren van vloeistoffen en gecombineerde geautomatiseerde MICRoscopy met een op maat ontwikkelde software script. Dit script maakt automatisch de kwantificering van de ontstekingsreactie met het noteren van het percentage gebied bezet door rood fluorescerende leukocyten binnen een empirisch gedefinieerde gebied rond gewonde green fluorescent neuromasts. Verder hebben we geautomatiseerde verwerking van gegevens, verwerking, visualisatie en opslag van alle op basis van op maat ontwikkelde MATLAB en Python scripts.
Kortom, introduceren we een geautomatiseerd HC / HT scherm dat het testen van chemische verbindingen kunnen op hun effect op initiatie, progressie of de resolutie van een granulocytaire ontstekingsreactie. Dit protocol biedt een goed uitgangspunt voor meer diepgaande analyses van drugs mechanismen en routes die betrokken zijn in de orkestratie van een aangeboren immuunrespons. In de toekomst kan het helpen identificeren van ondraaglijk giftige of off-target effecten bij eerdere fasen van drug discovery die daardoor procedurele risico's en kosten voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.
Protocol
1. Animal Handling Voor de Chin-test gebruik 3 dpf larven die voortvloeien uit de groep paringen tussen homozygote dubbel transgene cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 en AB (wild-type) vis. Verzamelen embryo door natuurlijke afzetten en deze op 29 ° C te verhogen in E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSÛ4 en 0,1% methyleenblauw, geëquilibreerd met pH 7,0) in Petrischalen. Het is essentieel het handhaven van een dichtheid van embryo's niet meer dan 50-70 per plaat. 2. Larve sorteren Controleer alle larven onder een fluorescentie stereoscoop voor TL-reporter expressie, spontane ontsteking en geschikte leeftijd gerelateerde ontwikkeling. 3. Screening Medium Voorbereiding (Altijd voor te bereiden vers) Bereid E3 medium zonder methyleenblauw aangevuld met DMSO (1% laatste) en MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Voorbereiding (Altijd voor te bereiden vers) Eerste afgewogen CuSO 4 (M r = 159,6 g / mol) en bereiden een 20 mM stockoplossing in dH 2 O. Bereid 120 uM CUSO4 werking (uit 20 mM voorraadoplossing) in E3/DMSO (1%) / MS-222. Bescherm CuSO 4-oplossing tegen licht. 5. 384-wells plaat Voorbereiding (Greiner 384 Nou Microplate) Pre-toe 20 ul E3/DMSO (1%) / MS-222 aan elk putje met een omgekeerde pipet. Een verhoogde pipetpunt boring is nodig om zorgvuldig omgaan met de embryo's zonder het toebrengen van een verwonding, dit wordt gedaan door het snijden van de tip om een 2 mm boring. Overdracht enkele larve in 74 ul medium aan elk putje (84 pl voor onbehandelde controle). Indien nodig, oriënteren larven in een zijdelingse positie in de put met een flexibele Eppendorf Microloader pipetpunt (Eppendorf; 5.242 956.003). Voer alle volgende stappen uit het hanteren van vloeistoffen met een robot vloeistofhet hanteren van werkstation naar gelijktijdige behandeling van alle larven te garanderen. 6. Medicamenteuze behandeling Meng verbindingen in drug voorraad plaat 5 keer door en neer te pipetteren. Voeg 16 pl van 7,5 x drug voorraad plaat aan elk putje en meng 5 keer. Pas tip positie in putten om letsel van de larven te voorkomen en afzien van het medium bij 10 pl / s. Meng medium putjes 4 keer homogene verdeling van het geneesmiddel te verzekeren in de put. 7. Incubatie Incubeer afschermplaat gedurende 1 uur bij 29 ° C met aluminiumfolie om verbindingen te beschermen en CuSO 4 van licht. 8. Chemische Verwonden Voeg 10 pi van 120 uM CUSO4 werkende oplossing in elk putje behalve negatieve controles mix 4 maal en incubeer opnieuw gedurende 1 uur bij 29 ° C. 9. Het wassen Verwijder en uit te wisselen 80 ul van mij dium uit elk putje tweemaal (20 ul stappen) verbindingen te verwijderen en CuSO 4. 10. Image Acquisition Start beeldacquisitie op een omgekeerde geautomatiseerde microscoop (dat wil zeggen: Olympus scan ^ R) 90 minuten na de eerste koper de behandeling. Stel de eerste Z-niveau, zodat neuromasts van rechts en links achterste laterale lijn zichtbaar zijn. Afbeelding elk putje een keer per uur in de kanalen helderveld, Cy3 en GFP in 4 focale vliegtuigen (50 micrometer afstand) met behulp van een 4x doelstelling (NA = 0,13). Meer informatie over beeld-en verwerking van gegevens zijn beschikbaar op aanvraag. 11. Beeldverwerking 1. Gegevens sorteren Ruwe beelden worden verwerkt met onze op maat LabVIEW software script. De eerste operatie in de beeldverwerking pijplijn is het sorteren van ruwe beelden van de microscoop gegenereerde data map per kanaal, goed en de tijd-point informatie. ove_step "> 2. Uitgebreide aandacht Vervolgens maakt de software verlengd scherpe beelden van vier beeldvlakken voor elk kanaal. 3. RGB-overlay In een laatste stap de uitgebreide aandacht beelden van de 3 kanalen worden samengevoegd om tot een uiteindelijke RGB-overlay beeld. 4. Geautomatiseerde detectie neuromast Een patroonherkenning tool (LabView Rapid IA prototyping tool) identificeert neuromasts binnen de RGB-overlay beelden samen tot een empirisch bepaald gebied in de omgeving van de neuromasts. 5. Kwantificatie Binnen het empirisch bepaald gebied van belang rond gewonde neuromasts rode tl-leukocyten (weergegeven als rode pixels) zijn gescoord, wat resulteert in een primaire uitlezing van p ercent een rede o ccupied door l eukocytes (Paol). Gemiddeld 95,27 ± 2,11% (FDA1) en 95,12 ±1,56% (FDA2) van putten (larven) zijn goed herkend en zijn vervolgens onderworpen aan verdere verwerking van gegevens. De ruwe gegevensuitgang (Paol elke gedetecteerde neuromast) wordt opgeslagen in een txt en dient als de data-invoer voor de MATLAB scripts de ruwe data verder te verwerken. 12. Data Processing 1. Imaps Het beoordelen van het succes van individuele experimenten van grafische visualisatie van de ruwe data-uitgang Paol in een kleur code kan worden gerealiseerd met zogenaamde ontsteking kaarten (imaps) (figuur 2). Bright groen weerspiegelt een hoge initiële inflammatoire index; zwarte kleur geeft geen ontsteking. Dit overzicht maakt voor de snelle identificatie van de mislukte experimenten, die vervolgens kunnen worden uitgesloten van verdere data-analyses. 2. Middelen van controles Elke experimentele plaat bevat 320 stoffen als gevolg van eeneen datapunt per verbinding en de tijd-punts en 32 positieve en negatieve controles, respectievelijk. De 32-controle replica van zijn gemiddelde en standaarddeviatie wordt berekend. Voor de controles alleen gegevens binnen 2 standaarddeviaties zijn opgenomen. 3. Normalisatie Normalisatie wordt gedaan door spreadsheet analyse. De gemiddelde waarde van DMSO, zijnde de negatieve controle, is ingesteld op 0 en de hoogste gemiddelde Paol voor de koper controle is ingesteld op 1, zodat het maximale verschil tussen de positieve en negatieve controle is ingesteld op 1. Elke verbinding van Paol wordt lineair geïnterpoleerde of geëxtrapoleerde aan de respectieve controle op de experimentele plaat. 4. Final weergave: Inflammatoire index Na voldoende duplo-experimenten (dwz 15) zijn uitgevoerd, worden genormaliseerde ruwe data van duplo-experimenten gemiddeld, wat resulteert in een laatste uitlezing – de inflammatoireindex. De eerste inflammatoire index van de koper controle begint bij 100% voor tijd-punt nul en correleert met beeldacquisitie starttijd (90 minuten na de eerste koper behandeling). 5. Monotone exponentiële regressie montage Door ontsteking resolutie tijd wij een monotoon niet-lineaire regressie exponentiële fitting naar de eerste ontsteking met – Een 0 is een maat voor de initiële respons op t = 0 wordt een 1 op een helling van de grootte tijd. 6. 2-D kenmerkruimte plot (figuur 4) Om de functie ruimte genereren, wordt een niet-lineaire regressie toegepast en een cluster-analyse verdeelt de kenmerkruimte in kenmerk gebieden, waardoor automatische identificatie van interessante kandidaten uit verschillende immuno-modulerende categorieën (anti-inflammatORY, anti-resolutie, pro-inflammatoire, pro-resolutie). Alle verbindingen worden weergegeven in de 2-D plot gebaseerd op de parameters a 0 en 1. 13. Verwerking en opslag Onze gegevens hanteren van routines te creëren webpagina's te visualiseren en te vertegenwoordigen zoals drugs-schermen bieden een snel overzicht van het beeld en de verwerking van gegevens stappen 'resultaten, evenals een gedetailleerde weergave op verzoek van de gebruiker 10. Soft links naar andere relevante heterogene biologische en chemische databases worden ook geïntegreerd om een waardevolle bron voor vergelijkende en nieuwe studies 11 te bieden. Door deze routines zijn de juiste gegevens normen en meta-informatie voor lange termijn opslag van deze gegevens. 14. Representatieve resultaten In een pilot-scherm analyseerden we een bibliotheek van 640 goedgekeurd door de FDA bekend bioactieve stoffen voor effecten op de initiatie, progressie of oplossen van een granulocytic ontstekingsreactie. Op basis van de waargenomen effecten we ingedeeld 4 types van het immuunsysteem van modulerende fenotypes die kunnen wijzen op de verschillende vormen van actie: anti-inflammatoire (1), anti-resolutie (2), pro-inflammatoire (3) en pro-resolutie (4) , dat kan worden beschreven met de parameters a 0 en 1, die voortkomen uit een monotoon niet-lineaire regressie fitting (e ao + alx -) naar de eerste ontsteking. A 0 stelt de grootte van de ontstekingsreactie dat een 1 kenmerkt de helling van de kromme en dus beschreven ontsteking resolutie. Weergave van alle verbindingen in een 2-D-functie ruimte plot (een 1 vs een 0) zorgt voor een geautomatiseerde identificatie van de hit kandidaten uit de verschillende immuun modulerende categorieën (figuur 3). 45 van de 640 verbindingen uitgeoefend belangrijke anti-inflammatoire werking door het verminderen van de eerste inflammatoire index tot 50% of minder. Binnen this categorie vonden we 6 verbindingen die behoren tot de farmacologische klasse van niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's), bevestiging van de geldigheid van onze aanpak. Echter, NSAID's gerangschikt niet een van de meest krachtige anti-inflammatoire geneesmiddelen. Afgezien van de NSAID's vonden we een aantal extra farmacologische drug klassen zoals bijvoorbeeld angiotensine receptor blokkers (ARB), antibiotica en proton pomp remmers. 7 verbindingen de empirisch vastgestelde drempel criteria voor potentiële pro-resolutie van drugs. 18 drugs oefende een pro-inflammatoir effect, wat resulteert in overdreven leukocyten rekrutering van gewonden neuromasts ten opzichte van de positieve controles. Slechts 2 verbindingen voorkomen tijdige oplossing van de ontstekingsreactie. De anti-inflammatoire effect van verschillende hit kandidaten (voorbeeldige kandidaten van bovengenoemde farmacologische drug klassen) van de piloot scherm Could bevestigd op een dosis afhankelijke manier in de daaropvolgende secundaire Chin assays (gegevens niet getoond). Hertesten van 4 mogelijke pro-resolutie van drugs niet bevestigen dat de aangegeven wijze van actie als uitgeoefend in het primaire scherm. 2 van de geneesmiddelen had een lichte ontstekingswerend bij hogere concentraties (20 pM). Een derde drug vertoonden een marginale niet-dosis-afhankelijke anti-inflammatoire werking op drugs concentraties variërend 5 tot 20 uM. De vierde geneesmiddel hadden geen effect op de inflammatoire respons in de geteste concentraties. Figuur 1. Workflow van de kin-test. Individuele compound transgene cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larven (3 DPF) worden handmatig verdeeld in 384-wells microtiterplaten. Drugs worden gelijktijdig aan elk putje toegevoegd met behulp van een Zephyr Compact Liquid Handling Workstation. Assay platen worden daarna gedurende 1 uur bij 29 ° C. Behandeling met CUSO4 </sub> – Oplossing (10 uM eindconcentratie) gedurende 1 uur toebrengt het verwonden en initieert een acute ontstekingsreactie. Tot slot worden koper-oplossing en drugs weggespoeld en geautomatiseerde beeldacquisitie wordt gestart (90 minuten na de eerste koper behandeling). Figuur 2. . Overzicht beeld van RAW-afbeeldingen De figuur laat zien RAW-afbeeldingen van 4 focale vlakken (Z = 0 – 3) op een afstand van 50 um in de kanalen Cy3 (links) en GFP (rechts), respectievelijk. Pijlen (Z = 1,2) geven aan voorbeeldige neuromasts, pijlpunten (Z = 1,2) punt van geclusterde leukocyten rond neuromasts. Figuur 3. Ontsteking Maps (imaps) Het succes van de individuele experimenten kunnen worden beoordeeld in imaps als gevolg van de ontstekingsreactie (ruwe data) in een kleurcode:. Bright groen weerspiegelt een hoge initiële inflatie mmatory reactie; zwarte kleur geeft geen ontsteking imaps op tijdpunt 0 (links) en time-punt 5 (rechts) laten duidelijk zien of er een experiment moeten worden opgenomen in de verdere verwerking van gegevens.. Koper controles (rij 13 en 24) verschijnen in verschillende tinten van groen, terwijl DMSO controle putten (rij 1 en 12) worden weergegeven in het donker groen of zwart. Op het moment-punt 5, is een ontsteking bijna opgelost in koper controles, nu aangegeven in donkere tinten groen of zwart. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken . Figuur 4. 2-D kenmerkruimte stuk 320 verbindingen van FDA bibliotheek en hun bediening. Alle wells verbinding kunnen worden weergegeven in een 2-D kenmerkruimte plot gebaseerd op de parameters a 0 en 1, welke voortkomen uit een niet-lineaire regressie fitting (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" Vergelijking 1 "/>) in de richting van de aanvankelijke ontsteking. deze functie de ruimte perceel maakt geautomatiseerde identificatie van interessante kandidaten die behoren tot een van de volgende 4 immuun-modulerende categorieën die kunnen wijzen op de geneesmiddelen 'mode van de actie:. anti-inflammatoire (1), anti-resolutie (2), pro-inflammatoire (3) en pro-resolutie (4) Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Discussion
<p class="jove_content"> Hier presenteren we een volledig geautomatiseerde high-throughput screening strategie die de identificatie van de immuun-modulerende verbindingen in een heel dier context. Zodat monitoring van een acute ontstekingsreactie<em> In vivo</em> En in real time.</p><p class="jove_content"> Wij bieden een protocol bij zebravis toe te passen als een waardevolle modelorganisme voor drug discovery of drugs herbestemming inspanningen, omdat de effecten van medicijnen op de leukocyten rekrutering van wonden kan worden bestudeerd met relatief gemak in het kader van een volledig functioneel aangeboren immuunsysteem. Het unieke van onze werkwijze is dat chemische verwonding handmatige manipulatie larven verouderd maakt, waardoor het mogelijk automatisering en screening in een hoge-doorvoer-formaat.</p><p class="jove_content"> Daarnaast kunnen schadelijke of toxische effecten van geneesmiddelen evenals een sterke off-doeleffecten gemakkelijk worden beoordeeld met de voorgestelde opzet. De FDA goedgekeurde bibliotheek maar bevatte geen giftige stoffen in de gegeven screening concentraties. Toch stellen wij voor de schijnbare toxische verbindingen om de beschikbare dataset (bijvoorbeeld immuun modulerende fenotype, concentratie van het geneesmiddel) tussen leden van dezelfde farmacologische stof klasse aanwezig is in de geteste bibliotheek te vergelijken. Giftige leden van een stof familie, die anders oefent een veelbelovende immuun modulerende fenotype, kunnen worden getest bij lagere concentraties, mocht dat nodig zijn.</p><p class="jove_content"> We hebben aangetoond dat de mogelijkheid van categoriseren van drugs automatisch op basis van hun uitgeoefend immuun-modulerend effect. Geneesmiddelen die behoren tot de categorie van anti-inflammatoire verbindingen kunnen worden gevalideerd onafhankelijke experimenten meeste van de verbindingen oefenen hun effect in een dosis-afhankelijke wijze. Vier verbindingen geïdentificeerd als potentiële pro-resolutie drugs kon tot nu toe niet worden bevestigd als zodanig. Het geeft ook aan dat deze specifieke immuun modulerende categorie is moeilijk te beschrijven, omdat er geen drugs alleen van invloed zijn resolutie zijn tot nu toe in de literatuur beschreven. Maar 3 van de 4 opnieuw worden getest drugs liet een anti-inflammatoire trend bij hogere molaire concentraties. Het optimaliseren van de empirisch vastgestelde drempel criteria zou moeten helpen om het aantal fout-positieven te verminderen.</p><p class="jove_content"> Voorts de voorgestelde methode biedt de mogelijkheid te worden gebruikt voor de identificatie van mutaties in genen die leukocyten migratiegedrag<sup> 8</sup>.</p><p class="jove_content"> Concluderend, de voorgestelde methode kan vergemakkelijken en te versnellen drug discovery of drugs herbestemming inspanningen door het afstaan van potentiële nieuwe lead structuren met direct beschikbare informatie over drugs-tolerantie, toxiciteit, dosering en de potentiële off-target effecten. Daarom, die als een eenvoudige, kosten-en tijdbesparende strategie in een vroeg stadium van de ontwikkeling van geneesmiddelen.</p>
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> Wij danken Nadeshda Wolf, Nadine Eschen en Susanne Delong voor een uitstekende veeteelt. CW werd ondersteund door een PhD beurs van de Helmholtz-programma '<em> BioInterfaces</em> Internationale graduate school '(BIFIGS). Verdere ondersteuning werd geleverd door een KIT-RISC-subsidie en door een Marie Curie International Reintegration subsidie binnen het 7e Europese kaderprogramma van de Gemeenschap (PIRG07-GA-2010 tot 267.552) naar CG. AHS werd ondersteund door BOLD (Biologie van lever en pancreas ontwikkeling en ziekte) – Marie Curie Initial Training Network (238.821). UL werd ondersteund door Dopaminet KP7 (Zevende Kaderprogramma) (223.744).</p>
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dimethyl sulphoxide | Carl Roth GmbH & Co KG | A994.2 | |
| Copper(II) sulphate anhydrous | Carl Roth GmbH & Co KG | PO23.1 | |
| FDA approved drug library | Enzo Life Sciences | BML-2841-0100 | |
| 384 microwell plate Non-binding, μClear | Greiner | 781906 | black |
| Olympus scan^R | Olympus | ||
| Zephyr Compact Liquid Handling Workstation | Caliper |
Referenzen
- Peterson, R. T., Fishman, M. C. Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish. Methods Cell Biol. 76, (2004).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).
- Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish. J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).
- Martin, J. S., Renshaw, S. A. Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease. Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
- Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation. Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).
- D’Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish. BMC Biol. 8, 151 (2010).
- Haas, P., Gilmour, D. Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line. Dev Cell. 10, 673-680 (2006).
- Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. Sciencenet’ – towards a global search and share engine for all scientific knowledge. Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).
- Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. Harvester’: a fast meta search engine of human protein resources. Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).
Diesen Artikel zitieren
Wittmann, C., Reischl, M., Shah, A. H., Mikut, R., Liebel, U., Grabher, C. Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish. J. Vis. Exp. (65), e4203, doi:10.3791/4203 (2012).