促进药物发现：斑马鱼在一个自动化的高含量检测炎症

1。动物处理为下巴实验使用3 DPF幼虫从组纯合的转基因双cldnB :: GFP的/ lysC :: DsRED2和AB型 （野生型）鱼交配，产生的。收集自然产卵胚胎，并提高他们在29°C在E3的介质（5 mM氯化钠，氯化钾0.17毫米，0.33毫米氯化钙 ， 硫酸镁 0.33毫米，0.1％亚甲蓝，平衡pH值7.0），在培养皿中。关键是要保持不超过每盘50-70胚胎密度。 2。幼虫排序根据荧光立体检查所有幼虫荧光记者表达的，自发的炎症和适当的年龄相关的发展。 3。筛选培养基的制备（始终准备好新鲜） 准备不辅以DMSO（最后1％）和MS222（0.05克/升）的亚甲蓝E3中。 4。硫酸铜准备（始终准备好新鲜） 首先掂量出硫酸铜（M R =159.6克/摩尔），并准备了20毫米原液DH 2 O。准备120微米硫酸铜工作在E3/DMSO（1％）/ MS-222解决方案（从20 mm原液）。保护光硫酸铜溶液。 5。 384孔板上下游（格雷纳384微孔板） 预反向移液器每孔加入20μLE3/DMSO（1％）/ MS-222。枪头缸径增加，需要仔细处理，没有造成任何伤人的胚胎，这是由切割2毫米口径的一角。传输介质，在74μL单幼虫，每孔（84μL）未经处理的控制。如果有必要，在卧位东方幼虫在井使用一个灵活的Eppendorf Microloader枪头（Eppendorf公司; 5242 956.003）。 机器人液体进行液体处理步骤处理工作站，以确保所有的幼虫同时治疗。 6。药物治疗吸取了混合药物股板块中的化合物的5倍。每孔加入16μl7.5X药物股板块的和混合的5倍。调整尖内水井的位置，防止幼虫的伤害，并免除在10μL/ s的介质。混合介质井的4倍，以确保药物均匀分布在井。 7。孵化筛选板孵育1小时，在29°C间用铝箔覆盖，避免光线的化合物，以及硫酸铜 。 8。化工伤人除了 ​​阴性对照组，混合4倍，每口井120微米硫酸铜溶液加入10微升，再次孵育1小时29°C。 9。洗涤删除和我交换80μL dium从每个井的两倍（20μL的步骤）删除化合物和硫酸铜 。 10。图像采集自动显微镜倒置（即：奥林巴斯扫描^ R）的图像采集开始90分钟后，初始铜治疗。设置初始Z-级，使左，右后外侧线neuromasts可见。图片每一次每小时渠道明，Cy3和GFP 4焦平面（50微米的距离）使用4倍的目标（，NA = 0.13）。 应要求提供额外的信息，图像和数据处理。 11。影像处理 1。数据整理 RAW图像处理与我们自定义的LabVIEW软件脚本。在图像处理管道的第一个操作是排序显微镜产生的数据通道，以及时间点的信息的文件夹中的原始图像。 ove_step“> 2。扩展的重点随后，该软件创建扩展为每个通道从4焦平面聚焦图像。 3。 RGB-覆盖在最后一步，从3个通道的扩展聚焦图像合并，导致最终的RGB叠加图像。 4。自动神经丘检测一个模式识别工具（LabView的快速IA原型工具）标识内的RGB叠加图像neuromasts和创建经验的兴趣周围neuromasts定义面积。 5。量化红色荧光白细胞（反映为红色像素）内的利息周围受伤neuromasts的的经验定义的区域都取得了主要由 L eukocytes（Paol）中的 p ercent 1 REAØccupied读数。在平均95.27±2.11％（FDA1）和95.12±井（幼虫）（1.56％FDA2）已正确检测并随后受到进一步的数据处理。原始数据输出（Paol为每个检测到的神经丘）被储存在一个txt文件，并作为进一步处理的原始数据的MATLAB脚本的数据输入。 12。数据处理 1。IMAPS 评估个别实验的颜色代码中的原始数据输出Paol图形可视化的成功，可以实现所谓的炎症地图（IMAPS）（ 图2）。明亮的绿色反映了较高的初始炎症指数，黑色表示没有炎症。这种快速概览，允许失败的实验，然后可以排除进一步的数据分析的快速识别。 2。平均控制每个实验板包含320化合物，反映了单个数据点每化合物和时间点以及32个阳性和阴性对照，分别。 32控制重复的平均值和标准偏差的计算。为控制的只有2个标准差之内的数据点都包括在内。 3。正常化正常化是通过电子表格分析。二甲基亚砜的平均值，作为阴性对照，设置为0，和最高的铜控制的的平均Paol是设置为1，因此，阳性和阴性对照之间的最大区别是设置为1。每个化合物的Paol，是线性插值或外推到各自的实验板控制。 4。最后读出：炎症指数后已进行了足够的重复实验（即15），平均归重复实验的原始数据，导致在最后读出 – 炎症索引。铜控制炎症的初始指数开始在100％的时间点零和相关图像采集开始时间（90分钟后，初始铜处理）。 5。单调的指数回归拟合由于解决炎症随着时间的推移，我们对所使用的初始炎症执行单调指数非线性回归拟合 – 0是在t = 0的初始响应的措施，有关斜坡的幅度随着时间的推移。 6。特征空间的2-D图（ 图4） 要生成的功能空间，非线性回归应用于集群分析划分为特征区域的功能空间，从而从不同的免疫调节类有趣的候选人自动识别（反-inflammat的存储器，反决议，亲炎症，有利于决议）。基于参数0和1的2-D图形显示在所有化合物。 13。数据处理和存储我们的数据处理例程创建网页，可视化和代表等药物屏幕，提供了图像的快速概览和数据处理步骤的结果，以及详细视图时，要求用户10。软链接到其他相关的异构生物和化学数据库集成，以及提供了宝贵的资源比较和新颖的研究11。通过这些例程，设置适当的数据标准和元信息这一数据的长期存储。 14。代表结果在试点屏幕上，我们分析了库，包括640 FDA批准启动，进展或决议的麻粒的影响，被称为生物活性化合物ocytic炎症反应。基于我们分为4种类型的免疫调节表型，可能预示不同的行动模式的观测效果：消炎（1），反决议（2），（3）促炎症和亲的决议（4） ，这可以用参数0和1，非单调线性回归拟合（ËAO + ALX – ）产生描述对初始炎症。一个0代表的炎症反应的程度，而1曲线斜率的特点，从而说明炎症决议。一个2-D的功能空间图（0与1）中显示所有的化合物，可以从不同的免疫调节类击中候选人（ 图3）的自动识别。 45出640种减少到50％或更少的初始炎症指数产生显着的抗炎作用。内氏s个分类，我们发现了6个化合物属于药物类的非甾体类消炎药（NSAIDs），证实了我们的方法的有效性，。然而，NSAIDs的排名当中最有力的消炎药。除了从非甾体抗炎药，我们发现了一些额外的药理类药物，如例如血管紧张素Ⅱ受体阻断剂（ARBs），抗生素和质子泵抑制剂。 7个化合物符合为潜在亲分辨率药物的经验定义的阈值标准。 18药物产生了亲消炎作用，在夸张白细胞招聘相比，阳性对照受伤neuromasts。 只有2种化合物，阻止炎症反应的及时解决。 几个候选命中消炎作用（模范候选人从上述药理类药物）从试点屏幕可以变成ð被证实在随后的二次下巴检测（数据未显示）的剂量依赖性。 4个潜在的亲分辨率药物复验未确认的行动施加在主屏幕的指示模式。 2药物在高浓度（20μM）轻微消炎潜力。第三个药物具有非剂量依赖性药物浓度范围从5边际消炎作用 – 20微米。第四药物有没有炎症反应的影响，在测试浓度。 图1。下巴检测工作流程。个人复合基因cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2幼虫（3 DPF）手动分布在384孔板。药物被同时添加到每口井使用西风紧凑型液体处理工作站。检测板孵育1小时，在29°C。 硫酸铜治疗</sub> – 解决方案（10微米的最终浓度）1小时，造成伤人和引发急性炎症反应。最后，铜溶液和药物洗掉和自动化图像采集开始初始铜治疗后（90分钟）。 图2。原始图像。概述图片的数字显示原始图像的4焦平面（Z = 0， – 3）在渠道Cy3标记（左）和GFP（右），分别为50微米的距离。箭头（z = 1,2）表示的模范neuromasts，箭镞在neuromasts周围聚集白细胞（z = 1,2）点。 图3。炎症地图（IMAPS）个别实验的成功可以反映炎症反应的颜色代码（原始数据）IMAPS评估：明亮的绿色，体现了高初始infla mmatory响应;黑色表示没有炎症，时间点0（左）和时间点5（右）IMAPS清楚地表明，实验是否应包括在进一步的数据处理。铜对照组（13和24行）显示在深浅不一的绿色，而，二甲基亚砜控制井（1和12行）出现暗绿色或黑色。在时间点5，炎症几乎是解决铜的控制，现在的绿色或黑色的暗色调。 点击这里查看大图 。 图4。 2维特征空间320 FDA的化合物情节批准库和各自的控制。所有化合物井可以在基于0和1的参数，从一个非线形产生的2-D的特征空间图显示回归拟合（d/4203/4203eq1.jpg“ALT =”公式1“/>对初步炎症）。此功能空间图允许自动识别属于以下4种免疫调节类药物可能指示一个有趣的候选人消炎“的行动模式：（1），抗决议（2），（3）促炎症和亲的决议（4） 点击这里查看大图 。