1. Embrioni transgenici Qui si sta utilizzando una linea transgenica di zebrafish creata attraverso un trasposone-mediata metodo trappola potenziatore 8. L'inserto transgenico comprende due sequenze codificanti: KalTA4, un pesce zebra versione ottimizzata del GAL4 attivatore trascrizionale, e la proteina fluorescente rossa, mCherry. La trappola enhancer rendimenti metodo linee di zebrafish transgenici che esprimono questa cassetta transgenici sotto il controllo di una sequenza endogena enhancer. Così, a seconda della identità della specifica sequenza enhancer, espressione di entrambi KalTA4 e mCherry è localizzata a specifiche regioni del cervello di sviluppo. Per la Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 linea che stiamo usando qui, l'espressione è localizzata a vari siti nel romboencefalo, proencefalo, e, di particolare importanza, il bulbo olfattivo 8 (vedi anche Fig. 1). . Dato questo modello di espressione e la localizzazione della cassetta all'interno del genoma, i transgeni si prevede di essere sotto il controllo del promotore zic4 8 (vedi anche http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ neuroimaging / lines_distel / main .). Et adulti (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 pesce eterozigote per l'inserto transgenici sono in genere accoppiati con WT (AB) di pesce, portando a circa il 50% prole transgenica. (Per una maggiore percentuale di prole transgenica, due eterozigoti possono essere accoppiati.) Al fine di bloccare la formazione di pigmento e facilitare l'imaging a fluorescenza, trattare gli embrioni transgenici con 100 mM N-phenylthiourea (PTU) inizio a 6-8 HPF. 2. Embrioni di montaggio A HPF 24-28, il trasferimento degli embrioni all'acqua uovo senza PTU. Identificare gli embrioni transgenici per l'espressione di mCherry utilizzando un microscopio a fluorescenza. Rimuovere la membrana corionica da embrioni transgenici con una pinza sottile. Trasferimento degli embrioni liberati dalla loro corion ad una piastra di Petri contenente tampone elettroporazione, più 0,02% tricaine [Buffer elettroporazione: 180 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 HEPES mM, pH 7,2] 4. Lasciare 2 minuti per l'anestetico abbia effetto prima di procedere alla fase di montaggio. Preparare una soluzione allo 0,5% a basso punto di fusione agarosio in tampone elettroporazione più tricaine dal microonde la soluzione, e poi mettendo la soluzione in un 34-37 ° C incubatore. Una volta che la temperatura della soluzione di agarosio è equilibrato, posto una grossa goccia (~ 500 microlitri) della soluzione di agarosio al centro di un piatto di 60 millimetri di Petri. Aggiungere 6-8 embrioni anestetizzati a questa goccia di agarosio. Utilizzando una pinza sottile (o le estremità multa di punte taglio pipetta microloader), posizione che gli embrioni in modo che essi sono tutti rivolti nella stessa direzione e allineati in una fila verticale. Per solidificare l'agarosio, e intrappolare gli embrioni in posizione, porre la capsula su un grande piatto di Petri con 2-3 mm di ghiaccio. Una volta che l'agarosio si è solidificato, inondare il piatto con elettroporazione tampone più tricaine, assicurando che la soluzione copre completamente il calo solidificato agarosio. 3. Micro-iniezione di espressione del DNA plasmidico Preparare il plasmide di espressione GFP utilizzando un kit midi o maxi-prep isolamento plasmide (ad esempio, Qiagen). Sospendere il plasmide ad una concentrazione finale di 0,5 mg / mL in acqua sterile, più 0,03% rosso fenolo. Per l'esperimento bulbo olfattivo targeting qui descritti, stiamo usando una espressione plasmide con la sequenza codificante del EGFP sotto il controllo di più GAL4 siti di legame (14 tandem sequenze UAS e il promotore di pesce basale, E1b). Usando questo plasmide, solo le cellule che esprimono il transgenically KalTA4 fattore di trascrizione sarà in grado di esprimere la GFP, così, mediando espressione mirata di GFP. Nota: qui stiamo usando rosso fenolo per la visualizzazione delle iniezioni di DNA, che dovrebbero essere applicabili per il targeting altre regioni del cervello in sviluppo, a condizione che la regione si può accedere dai ventricoli. Per il targeting di altri tipi di cellule che richiedono la visualizzazione fluorescente, Bodipy o Quantam coloranti Dot potrebbe potenzialmente essere usato per visualizzare le iniezioni sotto illuminazione fluorescente. Pipette microiniezione possono essere fabbricati utilizzando un estrattore pipetta orizzontale o verticale. Regolazioni di calore e pull-resistenza varia a seconda del tipo di estrattore, il tipo di elemento riscaldante, e il tipo di tubi di vetro capillari. Utilizzando un P-30 Sutter estrattore verticale, utilizzare un ambiente di calore di 980 e un divano-force di 960 per produrre lunghe, affusolate, pipette nitide da sottili pareti di vetro borosilicato capillare con filamenti [strumento Sutter # BF100-78-10]. Pipette Microinjetion tirato con queste impostazioni sono sigillate e devono essere rotto di nuovo prima dell'iniezione. Utilizzare un puntale microloader per aggiungere 1-2 ml di soluzione di DNA plasmidico alla pipetta di iniezione. Montare eassicurare la pipetta caricata nel supporto pressione pipetta di iniezione del sistema. Rompere di nuovo la pipetta caricato con una pinza sottile fino a produrre impulsi di pressione rilascio sbuffo della soluzione di DNA rosso. In alternativa, suggerimenti possono essere rotto di nuovo da rapidamente penetrare in un sommerso, Kimwipe piegato laboratorio. Nota: perché le pipette di iniezione sono inizialmente sigillata e deve essere manualmente rotto di nuovo, la dimensione della punta e il volume di iniezione sono variabili. Pipette di iniezione ideale dovrebbe richiedere 3-5 impulsi di iniezione per riempire completamente il ventricolo proencefalo sviluppo di 24 embrioni HPF (100 ms impulsi di iniezione a 40 psi). Iniettare la soluzione plasmide DNA nei ventricoli del cervello sviluppare tale che il DNA è costretto adiacente, e intercalate in, la regione del cervello destinata a formare il bulbo olfattivo. Il bulbo olfattivo è derivato dalle cellule della parete più anteriore del ventricolo proencefalo. Così, inserendo la pipetta di iniezione nei ventricoli in modo tale che la pipetta punta verso l'estremità anteriore del cervello di sviluppo, le forze di pressione di iniezione del DNA e nella adiacente al bulbo olfattivo potenziali. Iniettare DNA fino colorante rosso è ben visibile alla fine anteriore del ventricolo proencefalo. Perché il DNA comincia a diffondere immediatamente, diluendo il DNA, è importante procedere alla fase elettroporazione il più presto possibile dopo l'iniezione (ad esempio, entro 10 sec). 4. Elettroporazione Elettroporazione viene effettuato con auto-costruito elettrodi in elettrodi di platino Grass ipodermico (Grass Tecnologia # E2). Gli elettrodi sono collegati a un portatile sonda e la distanza finale tra gli elettrodi di platino deve essere di 1 mm (per i dettagli sulla costruzione v. 9). Onda quadra impulsi elettroporazione sono prodotti collegando gli elettrodi ad una SD-9 stimolatore Grass (erba Technology, modello SD-9). Impostare la SD-9 stimolatore per produrre singole, 5 impulsi di elettroporazione ms a 70 volt. Posizionare gli elettrodi in modo che l'elettrodo positivo è posizionato adiacente alla estremità anteriore dell'embrione, mentre l'elettrodo negativo è posteriore alla testa dell'embrione. Avviare manualmente ~ 7-8 impulsi di elettroporazione con l'interruttore singolo modalità dello stimolatore-9 SD, separando ogni impulso da ~ 1 sec. Tensioni appropriato varierà a seconda dell'età degli embrioni e la sorgente di tensione utilizzati. Giovane embrioni richiedono tensioni più basse per evitare danni all'embrione, mentre vecchi embrioni richiedono alte tensioni di avviare elettroporazione 7. Lasciare gli embrioni di recuperare per almeno 10 minuti dopo l'elettroporazione prima liberandoli dalla agarosio. Utilizzando una pinza sottile, senza gli embrioni dal agarosio delicatamente tracciare il contorno degli embrioni evitando il contatto reale con gli stessi embrioni. Una volta liberato, tornare gli embrioni di acqua uovo (con PTU se necessario). Tenerli a 28 ° C fino a che non devono essere ripreso per l'espressione della GFP. 5. Embrioni di montaggio per l'imaging Trasferimento degli embrioni da acqua uovo più PTU all'acqua uovo, più 0,02% tricaine. Lasciare qualche minuto per l'anestetico abbia effetto prima di procedere alla fase di montaggio. Preparare una soluzione allo 0,5% a basso punto di fusione agarosio nell'uovo acqua più tricaine dal microonde la soluzione, e poi mettendo la soluzione in un 34-37 ° C incubatore. Una volta che la temperatura della soluzione di agarosio è equilibrato, posto una grossa goccia (~ 300 ul) della soluzione di agarosio al centro di un piatto di 35 millimetri di Petri. Aggiungi un embrione anestetizzati a questa goccia di agarosio. Utilizzando una pinza sottile (o le estremità multa di punte taglio pipetta microloader), posizione che gli embrioni in modo che siano in posizione verticale, rendendo possibile visualizzare una vista dorsale di sviluppo del cervello con un microscopio verticale (ambiti invertita richiederà una diversa geometria embrione, e un piatto diverso consentendo la visualizzazione dal basso, vedi 12). Solidificare l'agarosio mettendo il piatto su un grande piatto di Petri con 2-3 mm di ghiaccio. Ri-orientamento con una pinza sottile sarà probabilmente richiesto durante la solidificazione di assicurare che l'embrione non possa cadere su un lato. Una volta che l'agarosio si è solidificato, inondare il piatto con l'uovo l'acqua più tricaine garantire che la soluzione copre completamente il calo solidificato agarosio. 6. Rappresentante dei risultati: Anche se l'espressione GFP può essere osservato a partire da 6 ore dopo l'elettroporazione, qui ci stanno mostrando le immagini da un embrione 4 giorni dopo l'elettroporazione in modo tale che la struttura dei neuriti delle cellule bersaglio è sufficientemente sviluppata. L'Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgenici linea trappola potenziatore visualizza espressione costitutiva di mCherry (e KalTA4) nel romboencefalo, cervelletto, proencefalo e nel bulbo olfattivo embrioni a 5 giorni dopo la fecondazione (Fig. 1A e 1C). Gli embrioni che hanno avuto un UAS-GFP plasmide di espressione incorporato mediante elettroporazione mirati (come descritto sopra), espressione di GFP dimostrano che è limitata alle cellule del bulbo olfattivo sviluppo (Fig. 1B, 1D e 1E). Transgenically solo le cellule che esprimono il fattore di trascrizione KalTA4 sono in grado di attivare l'espressione di questo SUP-GFP plasmide. L'incorporazione di questo plasmide in non transgenici embrioni non porta a qualsiasi espressione GFP rilevabile. Quindi, è l'azione combinata di elettroporazione mirata di UAS-GFP e localizzati espressione transgenica del driver KalTA4 che conduce alla espressione esclusiva di GFP nelle cellule del bulbo olfattivo sviluppo. Le cellule che esprimono GFP tipico spettacolo proiezioni assonali delle cellule bulbo olfattivo mitralico (Fig. 1B e 1D) 10. Al fine di visualizzare le proiezioni degli assoni, le immagini in figura 1B e 1D dovevano essere esposti ad alti livelli tali che la regione di corpi cellulari erano ben sovraesposta. Un livello inferiore di esposizione (Fig. 1E) mostra che i corpi delle cellule che esprimono GFP sono infatti localizzate nel bulbo olfattivo (cfr. Fig. 1C e 1E;. Linea grigia segna il confine del bulbo olfattivo). Figura 1. Mirate espressione GFP nel bulbo olfattivo di un embrione 5 dpf zebrafish. L'Et (zic4: Gal4TA4, UAS: mCherry) hzm5 transgenici linea trappola enhancer, display espressione costitutiva del mCherry nel cervelletto romboencefalo,, proencefalo, e bulbo olfattivo (A e C, mCherry fluorescenza mostrato in rosso). Questa espressione di mCherry è mediata da transgenico GAL4-espressione. Gli embrioni che sono stati elettroporate con un UAS-GFP vettore di espressione a 28 HPF, display espressione GFP mirati nel bulbo olfattivo a 5 giorni dopo la fecondazione (B, D ed E, GFP fluorescenza visualizzato in verde. Embrione Come in A e C). Un'immagine di esposizione più bassi in fondo (E) mostra che l'espressione di GFP è limitato a corpi cellulari del bulbo olfattivo. La linea grigia indica il confine del bulbo olfattivo. Campo chiaro (scala di grigi), fluorescenza verde (verde), e fluorescenza rossa (rosso) le immagini erano tutti prendere con un microscopio a fluorescenza Olympus BX60.