Preparação das Condições de Vida isolaram células Fotorreceptoras Vertebrados para imagens de fluorescência
Summary
Um método é descrito para a preparação de células vivas único fotorreceptoras de diferentes espécies de vertebrados para imagens de fluorescência. O método pode ser usado para a imagem da fluorescência de fluoróforos endógenos, como o NADH ou vitamina A, ou que de adicionado exogenamente corantes fluorescentes sensíveis ao Ca<sup> 2 +</sup> Ou outros fatores.
Abstract
Na retina de vertebrados, fototransdução, a conversão da luz em sinal elétrico, é realizado pela vara e células fotorreceptoras cone 1-4. Os bastonetes são responsáveis pela visão com pouca luz, cones de luz brilhante. Fototransdução ocorre no segmento externo da célula fotorreceptoras, um compartimento especializado que contém uma alta concentração de pigmento visual, o detector de luz primária. O pigmento visual é composto de um cromóforo, 11 – cis retinal, ligado a uma proteína, a opsina. Um fóton absorvida pelo pigmento visual isomeriza o cromóforo de 11 – cis para trans. Este photoisomerization traz uma mudança conformacional na pigmento visual que inicia uma cascata de reações que culmina em uma mudança no potencial de membrana, e provocar a transdução do estímulo luminoso em sinal elétrico. A recuperação da célula de estímulo de luz envolve a desativação da intermediários ativados pela luz, eo restabelecimento do potencial de membrana. Ca 2 + modula a atividade de várias enzimas envolvidas na fototransdução, e sua concentração é reduzida após estimulação luminosa. Desta forma, Ca 2 + tem um papel importante na recuperação da célula de estimulação luminosa e sua adaptação à luz de fundo.
Outra parte essencial do processo de recuperação é a regeneração do pigmento visual que foi destruída durante a detecção de luz pela photoisomerization de seus 11 – cromóforo cis para trans 5-7. Esta regeneração se inicia com a libertação de todos os trans-retinal do pigmento fotoativados, deixando para trás a opsina apo-proteína. O lançado all-trans retinal é rapidamente reduzida em uma reação utilizando NADPH para all-trans retinol e opsina combina com 11 fresco – cis retinal trazidos para o segmento externo para reformar o pigmento visual. All-trans retinol é então transferido para fora do segmento externo e para as células vizinhas pela transportadora especializada Protein Retinoid Interphotoreceptor Binding (IRBP).
Imagens de fluorescência de células fotorreceptoras único pode ser usado para estudar sua fisiologia e biologia celular. Ca 2 + sensíveis à corantes fluorescentes podem ser usados para analisar em pormenor a interacção entre o segmento externo Ca 2 + mudanças e resposta à luz 12/08, bem como o papel de interior segmento de Ca 2 + lojas em Ca 2 + homeostase 13,14 . Corantes fluorescentes também podem ser usados para medir a concentração de Mg 2 + 15, pH, e como marcadores de aquoso e compartimentos da membrana 16. Finalmente, a fluorescência intrínseca de all-trans retinol (vitamina A) pode ser usado para monitorar a cinética de sua formação e remoção das células fotorreceptoras única 17-19.
Protocol
Discussion
Se saudável células isoladas não são obtidas, o problema estará, ou com o isolamento ou a saúde da retina ou com a sua corte. Normalmente, após a remoção da parte frontal do olho e do vítreo, a retina prontamente decola do epitélio pigmentar. Se não, tente retire-a a partir da periferia da ocular. Se ainda é difícil separar, uma possibilidade provável é que o animal não tenha sido de adaptação ao escuro por um período de tempo adequado, ou a luz vermelha é muito brilhante. Assegurar a adaptação es…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Suportado pelo NEI conceder EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
Referenzen
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