הכנת מבודדים תאים חיים בעלי חוליות photoreceptor עבור דימות פלואורסצנטי
Summary
השיטה מתוארת להכנת יחיד photoreceptor תאים חיים ממינים שונים חוליות דימות פלואורסצנטי. השיטה יכולה לשמש התמונה פלואורסצנציה של fluorophores אנדוגני, כגון NADH או ויטמין A, או של exogenously צבעי ניאון הוסיף רגיש Ca<sup> 2 +</sup> או גורמים אחרים.
Abstract
ברשתית החוליות, phototransduction, ההמרה של האור לאות חשמלי, מתבצעת על ידי מוט חרוט תאים photoreceptor 1-4. Photoreceptors רוד אחראים ראייה באור עמום, חרוטים על רקע בהיר. Phototransduction מתרחש במגזר החיצוני של התא photoreceptor, תא מיוחד המכיל ריכוז גבוה של פיגמנט ויזואלי, גלאי אור ראשוני. פיגמנט ויזואלי מורכב chromophore, 11 – ציס רשתית, מחובר לחלבון, opsin. פוטון נספג על ידי פיגמנט הראייה isomerizes chromophore מ 11 – ציס לכל, טרנס. Photoisomerization זה מביא לשינוי קונפורמציה פיגמנט הראייה כי יוזם מפל של תגובות שהגיעו לשיאן שינוי פוטנציאל הממברנה, ולהביא על התמרה של גירוי האור לאות חשמלי. ההתאוששות של התא מפני גירוי האור כולל את שחרור משרות של ביניים מופעל על ידי אור, ואת כינונה מחדש של פוטנציאל הממברנה. Ca 2 + מודולציה את הפעילות של כמה אנזימים המעורבים phototransduction, וריכוז שלה הוא מופחת על גירוי אור. בדרך זו, Ca 2 + משחק תפקיד חשוב בתהליך ההחלמה של התא מפני גירוי האור והתאמתה אור רקע.
עוד חלק חיוני של תהליך ההחלמה הוא התחדשות של פיגמנט הראייה כי הושמד במהלך איתור לאור על ידי photoisomerization של 11 שלה – chromophore לכל cis-trans 5-7. התחדשות זה מתחיל עם שחרורו של טרנס כל הרשתית על ידי הפיגמנט photoactivated, והותיר אחריו opsin apo-החלבון. שוחררו כל טרנס רשתית מצטמצם במהירות התגובה לכל ניצול NADPH-טרנס רטינול, ו opsin משלב עם 11 טרי – רשתית cis להכניס קטע החיצוני לרפורמה פיגמנט הראייה. כל trans-רטינול הוא הועבר לאחר מכן מתוך קטע החיצוני לתוך תאים שכנים על ידי חלבון retinoid התמחה Interphotoreceptor המוביל הכבילה (IRBP).
דימות פלואורסצנטי של תאים photoreceptor יחיד יכול לשמש כדי ללמוד הפיזיולוגיה שלהם ביולוגיה של התא. Ca 2 + רגיש צבעי ניאון ניתן להשתמש כדי לבחון בפירוט את יחסי הגומלין בין קטע החיצוני Ca 2 + שינויים בתגובה האור 8-12, כמו גם את תפקידו של פלח Ca פנימי 2 + חנויות Ca 2 + הומאוסטזיס 13,14 . צבעי ניאון יכול לשמש גם למדידת Mg 2 + בריכוז 15, רמת החומציות, וכן קליעים נותבים של מימיות קרום התאים 16. לבסוף, הקרינה הפנימית של כל טרנס רטינול (ויטמין A) ניתן להשתמש כדי לפקח על קינטיקה של הקמתו והסרת תאים photoreceptor יחיד 17-19.
Protocol
Discussion
אם מבודדים תאים בריאים לא מתקבלים, הבעיה נעוצה גם עם בידוד או לבריאות של הרשתית או עם הקיצוץ שלה. בדרך כלל, לאחר הסרת הקדמי של העין ואת הזגוגית, הרשתית בקלות מרים את אפיתל הפיגמנט. אם לא, לנסות לקלף אותו החל בפריפריה של עיינית. אם זה עדיין קשה להפריד, אפשרות סבירה היא כי ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי מענק ניי EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources and infrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools (scissors, forceps, blade holder) | Roboz or Fine Science Tools | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments (Hamden, CT) | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
Referenzen
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y. Vertebrate Photoreceptors. Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. Adaptation in Vertebrate Photoreceptors. Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).
- Palczewski, K. G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin. Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Biochemie. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Biochemie. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
