Summary

一个简单的方法来衡量在果蝇的乙醇灵敏度

Published: February 19, 2011
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Summary

一个简单的实验来测量乙醇的镇静作用<em>果蝇</em>苍蝇的基础上翻正反射的损失,是描述。

Abstract

低剂量乙醇事业苍蝇成为亢进,而高剂量镇静。对一个给定的飞行应变乙醇诱导镇静的敏感性与菌株的乙醇偏好,因此,镇静是高度相关的措施,对酒精的反应和饮用水的遗传学研究。我们证明一个简单的方法,揭露苍蝇乙醇和衡量其醉人的影响。我们描述的检测可以判断急性灵敏度,以及酒精耐受重复曝光所致。它并不需要在技术上涉及的设置,并与基本的飞行文化工具,因此,可以在任何实验室应用。

Protocol

1。创建曝光室用刀片切一半一小瓶插头。另外,用棉球。 小瓶插件的一半,或将棉花球推的食品瓶的底部,使表面光滑,苍蝇不会卡住英寸如果多重曝光室,确保小瓶插头和食品,采取在每个分庭相同体积。一侧小瓶的标志,可以促进这项工作。 2。公开的苍蝇收集8苍蝇的性别,年龄1-5天,定期到无酵食品小瓶曝光的前一天。 标签代码,例如,实验者被蒙蔽的实际基因型/应变。 曝光室转移到由攻八苍蝇。不要麻醉。 200证明乙醇添加少量的食用染料,如酸性蓝9,使它很容易看到。 外套一小瓶插头的底部,或棉球,用0.5毫升乙醇。 乙醇插头插入曝光瓶。确保酒精到小瓶中,而不是对小瓶壁面临。 启动一个定时器计数。 3。记录乙醇引起的中毒开始后每分钟定时器,挖掘板凳上曝光室惊人死不休的苍蝇,并观察十秒钟他们。 记录每分钟固定苍蝇的数量。苍蝇是固定的,如果他们无法得到他们的背上,停留在一个位置,或在整个10秒的观察期的快速振动翅膀。后者苍蝇被认为是固定的,绝大多数是因为这些果蝇之间的快速翼运动时期固定。过得不固定,如果能得到他们的背上,走离和/或了小瓶墙。 一个暴露试验完成时记录为固定的4个或更多的苍蝇。 放弃苍蝇和曝光室内的空气,让以后重复使用。 4。确定的时间,以50%的镇静镇静(ST50)50%的时间是四个八个苍蝇保持静止时,乙醇暴露开始后的时间。这是决定如下: 无论是:第一次测量分钟时,整整四个苍蝇是固定的。 或者:如果少于4苍蝇(Y1)固定在一个时间点(分钟X),和四个以上的下一个测量时间点(Y2),(X +1分钟),然后线性插值ST50使用公式: ST50 =(4 – Y1)/(Y2 – Y1)+ X 5。重复曝光,以确定宽容公开的苍蝇 ST50(WT)确定为野生型控制在实验中使用的应变。 公开的苍蝇的实验组,乙醇如上所述。 测量其ST50(1),但继续揭露,直到你到达的时间2X ST50(WT)。 苍蝇转移到一个空的食品小瓶,并举行4小时。 重新暴露的苍蝇,并确定曝光2 ST50(2)。 确定公差计算公差(%)(ST50(2)/ ST50(1) – 1)X100。 6。代表性的成果: 如图所示,是我们每基因型和剂量的苍蝇与6-8小瓶获得的一些代表性的结果。如果您的标准误差是相当大,那么系统的问题可能发生。确保乙醇面临到曝光商会,该商会是相同体积。 图1。剂量响应曲线的野生型果蝇暴露于乙醇增加的百分比。八瓶的苍蝇暴露每剂和性别。雄性和雌性果蝇显示各剂量(P> 0.22,双向ANOVA)相同的ST50,而不同剂量ST50的增加乙醇剂量(P <0.001)显着降低。请注意,从过度拥挤的瓶子苍蝇,可以大大比那些从健康瓶,而这种规模的差异可以影响ST50。铺设种子每15-20女性瓶每瓶以获得最佳的幼虫密度为1-2天。 图2。苍蝇暴露无论是90%,或100%的乙醇再现先前所描述的乙醇阻力白色rabbit1 mutation2(P <0.001,2路ANOVA)引起的。 图3。重复暴露于100%的乙醇,间隔4小时的恢复时间间隔,在ST50的显着增加的原因后,第二次曝光(P <0.001,配对t测试)。请注意,果蝇暴露在24分钟的第一次接触(对应的两倍NA已经ST50)。一个较短的时间(12分钟)曝光并没有引起ST50时再曝光(数据未显示),显着增加。

Discussion

在此演示中,我们提出一个简单的方法来确定乙醇引起的中毒,根据Bainton等以前的实验。 2000年第1和Rothenfluh等。 2006年2。由于酒精引起的镇静与相关饮酒的偏好3,这个实验是有关酒精使用障碍的研究。惊吓引起的负面geotaxis描述该实验的基础上,和酒精暴露如何干扰这种先天的反应。开始暴露之前,确保您的苍蝇表明这样一个惊人死不休的一个正常反应,即的窃听食品瓶苍蝇后,他们都应该从底部10秒的观测时间内。苍蝇减少负面geotaxis的例子包括:邦的敏感扣押突变体5,6多巴胺神经元退化所造成的运动缺陷的苍蝇。

即使描述的实验是比较简单,两个变量最值得重视,以确保可重复的结果。首先,所有暴露瓶应该是相同的音量。这包括确保小瓶的底部,包含了食物+小瓶插头/棉球的相同体积,以及含有乙醇的插头插入相同的距离为每小瓶。一个完全空的小瓶,可以用于这个实验,但它会导致较长ST50值,降低检测吞吐量。

这种试剂盒也适用于确定容忍苍蝇的数量后重复乙醇暴露发展。做重复暴露时,应考虑一些变量。首先,暴露间的时间间隔是这里描述为4小时。这个变量可以改变,但我们建议不能低于2个小时,从第一次接触,以确保清理乙醇。见尔茨等。 2000年乙醇耐受性的发展和衰变的动力学4。第二个变量要考虑的是第一次接触的时间。这显然​​是相同的控制和实验苍蝇。但是,这会不会导致相同数量的乙醇交付给这两个飞株。镇静剂比2活跃的苍蝇苍蝇吸收更多的乙醇,因此应变sedates早期可能会收到一个较高剂量比以后镇静应变,从而开发出更多的宽容,由于较高的初始剂量。我们郑重提醒读者进行比较时,显示在初始ST50(1)不同的菌株,宽容的发展。

我们在这里描述的检测是一个有用的工具,方便和可重复苍蝇的行为反应,以确定酒精。

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢Aylin罗丹的手稿,批判性阅读和有益的讨论实验室成员。这项研究是由美国国立卫生研究院,R01AA019526支持。

Materials

Material Name Typ Company Catalogue Number Comment
Exposure vials   www.flystuff.com 32-116  
Plugs   www.flystuff.com 49-102  
Acid Blue 9   Sigma 861146  

Referenzen

  1. Bainton, R. J., Tsai, L. T. -. Y., Singh, C. S., Moore, M. S. . Curr. Biol. 10, 187-194 (2000).
  2. Rothenfluh, A., Threlkeld, R. J., Bainton, R. J., Tsai, L. T. -. Y. . Cell. 127, 199-211 (2006).
  3. Devineni, A. V., Heberlein, U. . Curr. Biol. 19, 2126-2132 (2009).
  4. Scholz, H., Ramond, J., Singh, C. S., Heberlein, U. . Neuron. 28, 261-271 (2000).
  5. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. . Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
  6. Feany, M. B., Bender, W. W. . Nature. 404, 394-398 (2000).

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Diesen Artikel zitieren
Maples, T., Rothenfluh, A. A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies. J. Vis. Exp. (48), e2541, doi:10.3791/2541 (2011).

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