Un modo semplice per misurare sensibilità etanolo in Flies

1. Creazione della camera di esposizione Tagliare una spina fiala a metà con una lama di rasoio. In alternativa, utilizzare batuffoli di cotone. Spingere la metà spina fiala, o il batuffolo di cotone, sul fondo del flacone cibo per fare una superficie liscia che vola non si blocca in Se rendendo camere di esposizione multipla, accertarsi che la spina flaconcino e cibo occupano lo stesso volume in ogni camera. Un segno sul lato del flaconcino può facilitare questo. 2. Esponendo le mosche Colleziona 8 vola di un sesso, età 1-5 giorni, il giorno prima dell'esposizione in flaconi cibo normale, senza lievito. Etichettarli in codice, in modo che lo sperimentatore è cieco al genotipo reale / ceppo usato. Trasferire le otto vola nelle camere di esposizione toccando. Non anestetizzare. Aggiungere una piccola quantità di colorante alimentare, ad esempio acido blu 9, a 200 etanolo prova per renderlo facilmente visibile. Rivestire il fondo di una spina fiala, o batuffolo di cotone, con 0,5 ml di etanolo. Inserire la spina di etanolo nel flaconcino di esposizione. Assicurarsi che l'alcol è rivolto nel flaconcino, e non verso la parete del flaconcino. Avviare un timer che conta su. 3. Record etanolo-indotta intossicazione Ogni minuto dopo che il timer viene avviato, toccare la camera di esposizione in panchina far trasalire le mosche e osservare per dieci secondi. Registrare il numero di mosche stazionaria per ogni minuto. Le mosche sono stazionari se non possono scendere le spalle, rimangono in una posizione, o in rapida vibrare le ali durante l'intero dieci secondi periodo di osservazione. Le mosche ultimi sono considerati fissi, perché la stragrande maggioranza di queste mosche sono fermi tra i periodi di rapido movimento dell'ala. Le mosche non sono stazionari se possono scendere le spalle e piedi e / o sulla parete flaconcino. Una prova di esposizione è terminata quando 4 o più mosche sono registrate come stazionaria. Gettare le mosche e lasciare che l'aria camera di esposizione per poi riutilizzare. 4. Determinare il tempo al 50% sedazione Il tempo per il 50% sedazione (ST50) è il tempo dopo l'inizio dell'esposizione etanolo quando quattro degli otto mosche rimangono stazionari. Ciò è determinato come segue: In entrambi i casi: il minuto prima misurazione quando esattamente quattro mosche sono stazionarie. Oppure: se meno di quattro mosche (Y1) sono fermi ad un certo punto il tempo (minuti X), e più di quattro (Y2) al punto successivo tempo di misura (minuti X +1), poi linearmente interpolare i ST50 con la formula: ST50 = (4 – Y1) / (Y2 – Y1) + X 5. Ripetere l'esposizione di determinare tolleranza Esponendo le mosche Determinare la ST50 (peso) per la wild-type di controllo utilizzati nell'esperimento. Esporre i gruppi sperimentali di mosche in etanolo come descritto sopra. Misurare la loro ST50 (1), ma continua a esporre fino a raggiungere il tempo 2x ST50 (in peso). Trasferire le mosche nuovamente dentro una fiala vuota cibo, e tenere premuto per 4 ore. Ri-esporre le mosche, e determinare il ST50 (2) di esposizione 2. Determinare tolleranza Calcolare la tolleranza in% (ST50 (2) / ST50 (1) – 1) x100. 6. Rappresentante dei risultati: Qui, ci sono alcuni risultati rappresentativi abbiamo ottenuto con 6-8 fiale di mosche per genotipo e la dose. Se l'errore standard è sostanzialmente più grande, poi un problema sistematico probabilmente si è verificato. Assicurarsi che l'etanolo si affaccia nelle camere di esposizione, e che le camere sono lo stesso volume. Figura 1. Curva dose-risposta di tipo selvatico vola esposti a percentuali crescenti di etanolo. Otto fiale di mosche sono state esposte per dose e sesso. Moscerini maschi e femmine mostrano la ST50 stesso ad ogni dose (p> 0,22, 2-way ANOVA), mentre l'ST50 attraverso le dosi riduce significativamente con l'aumento della dose di etanolo (p <0,001). Si noti che vola da sovraffollati bottiglie possono essere notevolmente più piccoli di quelli da bottiglie sano, e questa differenza di dimensioni può influenzare la ST50. Semi di ogni bottiglia con le femmine 15-20 che per 1-2 giorni per ottenere la densità ottimale larvale a bottiglia. Figura 2. Esporre vola a uno etanolo al 90%, o 100% riproduce descritti in precedenza etanolo-resistenza causata dal bianco rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-way ANOVA). Figura 3. Ripetete l'esposizione al 100% di etanolo, distanziate da un intervallo di recupero di 4 ore, causa un significativo aumento ST50 dopo la seconda esposizione (p <0,001, paired t-Test). Si noti che le mosche sono stati esposti per 24 minuti durante la prima esposizione (corrispondente al doppio della loro ve na ST50). Esposizione per un tempo più corto (12 minuti) non ha causato un aumento significativo ST50 su ri-esposizione (dati non riportati).